天花粉蛋白通過下調p-ERK及Cyclin D1表達抑制PC3細胞增殖

黃益玲 胡火軍 尤程程 黃迎娣 黃利鳴 (三峽大學醫學院病理學系，湖北 宜昌 443002)

天花粉蛋白(TCS)是一種單鏈核糖體失活蛋白，從葫蘆科植物栝蔞的塊根中提取出來。TCS早期主要用于引發中期流產，近年研究表明，TCS有多種生物學活性，能夠抑制人獲得性免疫缺陷病毒復制、調節人體免疫功能、抑制腫瘤細胞生長〔1〕。關于TCS對人前列腺癌的抑制作用尚未見報道。本實驗主要研究TCS在體外對前列腺癌細胞(PC3細胞)的增殖抑制作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞與主要試劑 RPMI1640培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，噻唑藍(MTT)購于美國Amresco公司，碘化丙啶(PI)及RNA酶(RNase A)購自Sigma公司，一抗ERK、p-ERK、Cyclin D1購自 Cell Signal公司，β-actin、二抗 HRP 標記的IgG抗體購于Santa Cruz公司，TCS購自上海金山制藥廠。

1.2 細胞培養 PCa PC3細胞為本實驗室傳代保存，培養于含10%的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2的濕化孵箱中常規培養。

1.3 MTT法測定TCS對PC3細胞的增殖抑制作用 取對數生長期的PC3細胞，以2×104個/ml的密度接種于96孔板，細胞貼壁 后 加 入 不 同 濃 度 的 TCS(0、20、40、60、80、100、120 μg/ml)，每個濃度設置6個復孔，繼續培養 24、48、72 h 后每孔加入5g/L的 MTT溶液 20 μl，繼續培養4 h后加入200 μl DMSO溶解，測定570 nm處光吸收值，計算細胞生長抑制率。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期 離心收集經TCS處理的PC3細胞，用含0.2%FBS的PBS清洗，加75%的冰冷乙醇固定，10000 r/min條件下離心5 min，去乙醇，以PBS洗滌兩次，棄上清。用0.5 ml PBS重懸細胞沉淀，加入等體積的細胞裂解緩沖液(1%NP-40，50 mmol/L Tris-HCl，40 mmol/L EDTA，pH 值7.5)室溫作用5～10 min，離心后加入終濃度為30 μg/ml的RNase于37℃水浴中消化 30 min，離心，10000 r/min離心5 min，加人1 ml終濃度為50 μg/ml的 PI避光染色 30 min，上流式細胞儀檢測，Multicycles軟件分析結果。

1.5 Western印跡檢測 離心收集經不同濃度TCS處理的PC3細胞，加入適量的細胞裂解液(注意臨用前加入各種蛋白酶抑制劑)提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，保證樣本中含有相同的蛋白含量，置95℃ ～100℃沸水中變性5 min，加入等體積2×SDS-PAGE加樣緩沖液行12.5%的SDS-PAGE垂直電泳，電轉至PVDF膜，加50 g/L脂奶粉于室溫封閉1 h，PBST洗膜，分別加入一抗ERK、p-ERK、cyclin D1及β-actin于4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗滌3次，ECL反應液A和B混合后加至膜上1 min，最后X片顯影。

1.6 統計學方法 應用SPSS14.0軟件行單因素方差分析。

2 結果

2.1 MTT法測定TCS對PC3細胞增殖的抑制作用 1 d TCS對PC3細胞的生長抑制作用隨其濃度的增大而加強，與未加藥物的對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度TCS作用24、48、72 h對PC3細胞增殖的抑制作用(±s，n=3)

表1 不同濃度TCS作用24、48、72 h對PC3細胞增殖的抑制作用(±s，n=3)

與0 μg/ml組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

g/ml 0±1.520±3.520±2.3420 μg/ml 6.3±2.1314.53±3.451) 23.49±2.642)40 μg/ml 11.2±1.741) 25.96±3.772) 42.12±4.232)60 μg/ml 19.7±3.222) 47.62±2.062) 66.63±3.222)80 μg/ml 23.63±1.692) 52.81±3.132) 70.34±4.142)100 μg/ml 38.5±2.752) 72.78±4.252) 82.98±2.672)120 μg/ml 57.8±3.622) 79.23±2.762) 91.21±3.542)24 h 48 h 72 h 0 μ組別

2.2 TCS對PC3細胞周期的影響 流式細胞儀檢測經20、40、80 μg/ml TCS作用24 h后PC3細胞周期情況，結果顯示，處于G1期的細胞比例分別為(37.4±0.45)%、(42.1±0.25)%、(59.9±0.09)%，與TCS未處理組(29.9±0.25)%相比差異顯著，表明TCS能引起PC3細胞發生G1期阻滯。

2.3 Western印跡檢測ERK、p-ERK、Cyclin D1表達 以β-actin為內參，經 20、40、80 μg/ml TCS 處理 PC3 細胞 24 h 后，p-ERK的表達受到抑制，且抑制作用隨藥物濃度的增加而加強，而Cyclin D1的表達呈明顯下降趨勢，見圖1。

圖1 TCS對P-ERK、ERK及Cyclin D1表達的影響

3 討論

部分前列腺癌患者發現時已發生侵襲和轉移〔2〕，晚期前列腺癌患者平均經過2年的內分泌治療后會進展為激素難治性TCS(HRPC)〔3〕，化療是激素難治性前列腺癌的主要治療手段。

細胞過度增殖會導致疾病的發生，甚至腫瘤的形成。抑制信號轉導通路中某一信號轉導分子的表達從而阻斷異?；罨男盘栟D導通路是腫瘤治療的策略之一。絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路存在于大多數細胞中，將細胞外刺激信號轉導至細胞內，引起細胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生化反應〔4〕。ERK信號通路是 1993 年由 Her等〔5〕人發現的一條MAPK信號通路。ERK1/2亞功能區中的酪氨酸和蘇氨酸殘基可發生磷酸化激活，激活的ERK1/2由胞質移位至細胞核后磷酸化一系列轉錄因子〔6〕，調控細胞的增殖和分化過程。細胞周期是細胞生命活動中的重要過程，其關鍵是G1期的啟動。Cyclin D1是Fu等〔7〕從甲狀旁腺腺瘤中克隆、鑒定出來的一種細胞周期蛋白。研究發現，Cyclin D1是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白，Cyclin D1過表達可導致G1期縮短，降低細胞對外源性有絲分裂刺激的依賴性〔8〕，使腫瘤細胞不依賴于細胞外生長信號的刺激而反復自發進行細胞周期循環。

TCS在臨床上主要用于引產及宮外孕、葡萄胎、絨癌等疾病的治療，因其具有N糖苷酶活性，使核糖體發生不可逆性失活而抑制蛋白質的合成〔9〕，體外實驗發現TCS對結腸癌、肺癌、黑色素瘤等腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用〔1〕。本課題組前期研究發現，TCS能通過誘導凋亡抑制宮頸癌Hela細胞的生長〔10〕。本實驗顯示TCS能明顯抑制PC3細胞生長，隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，TCS對PC3細胞的生長抑制作用逐漸增大，具有時間及劑量依賴性。TCS抑制Pca細胞增殖的可能機制為TCS能抑制ERK磷酸化從而抑制ERK-MAPK信號通路活性，TCS誘導的G1期阻滯與前列腺癌抑制細胞周期調節蛋白Cyclin D1的表達有關。對前列腺癌抗癌機制的進一步研究，有望使其應用于前列腺癌等腫瘤的臨床治療。

1 Shawp C，Lee KM，Wong KB.recent advances in trichosanthin，a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Toxicon，2005;45(6):683-9.

2 楊裕華，王際莘，賀法憲.前列腺癌二級預防研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(2):722-5.

3 Shen MM，Abate-Shen C.Molecular genetics of prostate cancer:new prospects for old challenges〔J〕.Genes Dev，2010;24(18):1967-2000.

4 Kim EK，Choi EJ.Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1802(4):396-405.

5 Her JH，Lakhani S，Zu K，et al.Dual phosphorylation and autophosphorylation in mitogen-activated protein(MAP)kinase activation〔J〕.Biochem J，1993;296(1):25-31.

6 De Luca A，Maiello MR，DAlessio A，et al.The RAS/RAF/MEK/ERK and the PI3K/AKT signalling pathways:role in cancer pathogenesis and implications for therapeutic approaches〔J〕.Expert Opin Ther Targets，2012;16(2):17-27.

7 Fu M，Wang C，Li Z，et al.Cyclin D1:normal and abnormal functions〔J〕.Endocrinology，2004;145(12):5439-47.

8 Seo JH，Jeong ES，Choi YK.Therapeutic effects of lentivirus-mediated shRNA targeting of cyclin D1 in human gastric cancer〔J〕.BMC Cancer，2014;14:175-80.

9 汪 猷，金善煒.天花粉蛋白〔M〕.第2版.北京:科學出版社，2000:158.

10 黃益玲，胡火軍，黃利鳴，等.天花粉蛋白誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的分子機制研究〔J〕.中國藥理學通報，2007;23(1):99-101.

〔2014-12-03修回〕