p75NTR介導神經細胞凋亡對老齡鼠學習記憶的影響及補腎方藥的作用

康湘萍 梁 超 金國琴 張學禮 龔張斌 夏花英

(上海中醫藥大學基礎醫學院生化教研室，上海 201203)

伴隨衰老，機體會出現一系列生理功能下降或紊亂的表現，尤其是腦結構和功能的改變，后者會直接導致老年人認知能力進行性損害，影響老年人的活動能力及生活質量，給家庭、社會帶來沉重的負擔〔1～3〕。中醫認為腎乃先天之根，封藏之本;《靈樞·經脈》云:“人之情與志，皆藏于腎”;故歷年來補腎益精填髓被中醫臨床用作改善學習記憶退化的重要治則。本研究以中醫衰老腎虛理論為指導，從sortilin腦源性神經生長因子前體(proBDNF)-p75NTR介導的神經細胞凋亡入手，進一步探究老年學習記憶能力減退的分子機制，同時觀察經典補腎方藥左歸丸及其君藥熟地黃對該途徑的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 左歸丸組成:熟地黃20 g、山藥10 g、菟絲子10 g、枸杞子 10 g、山茱萸 10 g、牛膝 7.5 g、龜板膠 10 g、鹿角膠10 g，上述中藥均購自上海康橋中藥飲片有限公司，湯藥常規方法煎煮，最終濃縮為含生藥1 g/ml的煎液，-20℃保存;熟地黃水煎后過濾，濃縮為每1 ml藥液含2 g生藥的提取藥液，-20℃保存，臨用前飲用水稀釋后灌胃使用。

1.2 動物造模及分組 雄性SD大鼠，SPF級，體重(250±30)g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(滬)2009-0069。大鼠稱重后隨機分為五組:青年對照組、衰老模型組、衰老左歸組、衰老熟地大劑量組(簡稱衰老熟大組)及衰老熟地小劑量組(簡稱衰老熟小組)。除青年對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射D-半乳糖生理鹽水500 mg/kg，連續造模56 d〔4〕，青年對照組腹腔注射等量生理鹽水;衰老左歸組灌服左歸丸藥液，劑量相當于臨床成人每kg體重劑量的7倍〔5〕，衰老熟大組灌服熟地黃藥液8 g/kg體重，衰老熟小組灌服熟地黃藥液4g/kg體重，青年對照組和衰老模型組灌服蒸餾水，每只大鼠的灌胃體積均為4 ml，連續56 d〔6〕。

1.3 試劑與儀器 D-半乳糖(上海國藥集團化學試劑有限公司)、化學發光試劑盒(ECL)(Pierce公司)、PVDF膜(Milipore公司)、proBDNF抗體、sortilin抗體(Abcam公司)，p75NTR抗體、caspase-3抗體、bcl-2抗體、bax抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling公司)，超薄切片機(Leica Ultracut R)，透射電鏡(型號:Philips Tecnai-12 Biotwin)，蛋白電泳儀、電泳槽、轉移槽(Bio-Rad公司)及凝膠成像分析系統(美國Protein Simple公司，FCM型)。

1.4 空間學習記憶能力測試 采用Morris水迷宮法，平臺設于迷宮西南象限正中，水面高出平臺1.5 cm，水溫19℃ ～20℃，大鼠連續訓練5 d，2次/d，分別從正北、正東兩個起始點投放，設定最長游動時限為70 s，電腦自動計時，記錄大鼠找到平臺所需要的時間，即潛伏期。如大鼠70 s內未能找到平臺，潛伏期計為70 s。記錄各組大鼠每天兩次潛伏期(s)，取均值。

1.5 透射電鏡觀察海馬神經細胞凋亡情況 海馬組織分離后切成1 mm×1 mm×3 mm的長條小塊，2.5%戊二醛固定，pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，再用1%鋨酸固定，梯度酒精、丙酮脫水，618樹脂浸透包埋，超薄切片機切片，3%醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察、拍片。

1.6 Western印跡法檢測海馬組織proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達 分別提取各組大鼠海馬蛋白，雙縮脲法定量蛋白并根據測定結果稀釋處理蛋白。SDSPAGE電泳，上樣量為40 μg蛋白/孔，電泳結束后，300 mA恒流轉膜60 min，然后37℃、5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜(所有一抗的稀釋比例均參照抗體說明書)。次日，0.1 mmol/L PBST(pH7.4)洗膜后加入二抗(1∶10000 倍稀釋)，37℃孵育45 min，PBST洗膜后ECL顯色檢測結果，并求積分密度值(IOD)。

1.7 統計學處理 采用SPSS17.0軟件，所有數據均以±s表示，組間比較采用t檢驗、重復測量數據的方差分析〔7〕。

2 結果

2.1 Morris水迷宮檢測各組大鼠空間學習記憶能力 隨著訓練天數增加，各組大鼠潛伏期(s)呈逐漸縮短趨勢。從訓練的第4天起，衰老模型組潛伏期較青年對照組明顯延長(P＜0.05)，衰老熟大組較衰老模型組潛伏期顯著縮短(P＜0.05);從游泳的軌跡上看，青年大鼠多以直線式和趨向式為主，而衰老模型大鼠多以邊緣式為主，見表1，圖1。

2.2 電鏡檢測各組大鼠海馬神經細胞凋亡情況 青年對照組大鼠海馬神經元形態及染色質正常，核較小，可見線粒體及內質網;衰老模型組大鼠海馬神經元體積較小，著色深，周邊線粒體可見明顯腫脹，核仁完整，核仁有固縮現象;衰老左歸組、衰老熟大組及衰老熟小組大鼠海馬神經細胞體積略有縮小，細胞形態較完整，周邊線粒體略有腫脹，核仁完整，略有固縮，見圖2。

表1 左歸丸及熟地對各組大鼠潛伏期的影響(±s，n=10，s)

表1 左歸丸及熟地對各組大鼠潛伏期的影響(±s，n=10，s)

與青年對照組比較:1)P＜0.05;與衰老模型組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年對照組 63.9±4.157.3±5.3855.6±6.139.8±3.725.4±2.2衰老模型組 70.0±0.066.9±3.163.6±3.361.1±3.71)54.8±3.91)衰老左歸組 63.1±4.764.0±4.463.8±3.156.0±3.747.1±4.4衰老熟大組 67.1±2.967.8±1.564.6±3.659.3±3.851.6±4.6衰老熟小組 68.7±1.366.0±2.258.3±5.343.5±3.02)34.1±2.32)

圖1 各組大鼠典型運動軌跡圖

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠海馬神經細胞凋亡情況

2.3 Western印跡法檢測海馬組織proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達 如表2、圖3所示，與青年對照組比較，衰老模型大鼠海馬proBDNF、caspase-3、bax表達明顯升高，bcl-2表達明顯降低(P＜0.05)，p75NTR和sortilin表達有升高的趨勢;與衰老模型組比較，左歸丸、熟地均能不同程度地降低衰老模型大鼠海馬proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3及bax蛋白表達，提高bcl-2蛋白表達。

表2 左歸丸及熟地對各組大鼠proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達的影響(±s，n=7)

表2 左歸丸及熟地對各組大鼠proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達的影響(±s，n=7)

proBDNF p75NTR sortilin caspase-3 bcl-2 bax青年對照組 0.393±0.0360.353±0.0650.388±0.0490.121±組別0.0280.638±0.0420.319±0.049衰老模型組 0.676±0.0481) 0.571±0.0970.747±0.0900.700±0.0491) 0.169±0.0301) 0.727±0.0531)衰老左歸組 0.520±0.0282) 0.502±0.0760.645±0.0930.349±0.0602) 0.390±0.0412) 0.520±0.0542)衰老熟大組 0.493±0.0492) 0.468±0.0830.605±0.0810.362±0.0602) 0.318±0.0362) 0.617±0.047衰老熟小組 0.448±0.0452) 0.462±0.0790.578±0.0590.257±0.0202) 0.370±0.0452) 0.495±0.0462)

圖3 各組大鼠海馬proBNP、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2、bax 蛋白表達

3 討論

D-半乳糖致衰老是根據衰老的代謝學說建立起來的造模方法，具有造模時間短、操作簡便、重復性好等優點，可表現出和自然衰老大鼠相似的衰老體征〔8〕，尤其是學習和記憶保持能力的降低〔9〕。

BDNF屬于神經營養素(NT)蛋白家族中的一員，是神經元與神經膠質細胞的重要營養因子，被認為是學習記憶過程中的關鍵蛋白之一〔10，11〕。與其他神經營養因子一樣，BDNF由其前體物質proBDNF裂解而成。在很長一段時間內，proBDNF被認為只是單純的蛋白前體分子而不具有生物學活性，直到1997年，Dicou等〔12〕首次報道proBDNF與成熟的BDNF同樣具有生物學活性;后續大量研究也證實〔13，14〕，proBDNF 可能有著和BDNF相反的生物學功能，能夠降低老齡大鼠的學習記憶能力。神經營養素有兩種受體即低親和力受體p75NTR和高親和力受體Trk，BDNF通過其高親和力受體TrkB的介導作用，最終可以影響海馬神經元突觸可塑性和學習記憶功能，在LTP的形成中具有非常重要的作用〔15〕;而proBDNF則與p75NTR以高親和力結合，激活p75NTR介導的細胞凋亡，并且這種結合需要有一種特定的膜蛋白，這種膜蛋白就是sortilin，它是一個相對分子量為95 kD的Ⅰ型膜糖蛋白，在神經系統和肌肉中廣泛表達。研究表明〔14，16〕，sortilin是與 proBDNF 及 p75NTR 結合形成三聚體從而啟動caspase依賴性神經細胞凋亡，最終導致神經元退行性疾病的發生。

本研究結果提示sortilin-proBDNF-p75NTR啟動的細胞凋亡可能是導致增齡性學習記憶能力減退的重要原因之一。

老年性學習記憶減退屬于中醫“健忘”的范疇，其病位在腦而本于腎，“腎虛、髓海不足”是學習記憶減退的主要病機，故治療當以補腎填精益髓為主。左歸丸為明代張景岳所創，是補腎填精的名方，方中重用熟地黃滋腎益精，以填真陰，為君藥;有研究表明〔17〕，熟地黃能改善D-半乳糖致衰老大鼠學習記憶能力，提高腦組織的抗氧化能力，延緩腦細胞衰老的進程。本研究的結果也表明，左歸丸與熟地黃能不同程度地改善神經細胞凋亡，下調衰老大鼠海馬 proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3及bax蛋白表達，上調bcl-2蛋白表達，從而改善衰老大鼠的學習記憶能力，延緩衰老。

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