直接與間接接觸共培養對誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的影響

謝盈彧 曹 楊 方子寒 張夢迪 薛 亮 范英昌 (天津中醫藥大學，天津 30093)

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一類存在于骨髓中的具有多種分化潛能的非造血多能干細胞，在不同的誘導條件下，BMSCs可以分化為心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及神經細胞等多種類型的組織細胞〔1，2〕，因其容易獲得，不存在免疫排斥等優點而被看作組織工程的“種子細胞”〔3〕。研究提示微環境在誘導BMSCs向心肌細胞分化中的重要作用，其中采用的共培養技術提供了一個非常好的研究影響細胞生長和分化的各種體內因素的模型〔4〕。本實驗以大鼠BMSCs與新生大鼠心肌細胞共培養模擬心肌內環境，研究心肌直接接觸、transwell小室建立的間接接觸培養對BMSCs分化的影響，獲取BMSCs向心肌細胞分化的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器及試劑 清潔級Wistar雄性大鼠，(200±20)g，中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心，動物許可證號:scxk2005-0001)5%二氧化碳(CO2)恒溫培養箱(Thermo);倒置相差顯微鏡(XD-10198010);凝膠圖像分析儀(Pramega公司);PCR儀為PE29600DNA熱循環儀(Perkin2ElmerCetus)。L-DMEM培養基(美國GIBCO公司);特級胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司);胰蛋白酶(1∶250，美國Hyclone公司);Percoll(Parmacia);乙二胺四乙酸(EDTA，天象人生物技術研究所 );青、鏈霉素(Hyclone);D-Hank液(南京化學試劑廠);CD44兔多克隆抗體(HCAM)，CD34兔多克隆抗體(Rabbit Anti-CD34)，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒AR1025，均由武漢博士德生物工程有限公司提供;磷酸鹽緩沖液(PBS)，95%乙醇，Triton-X-100(AMRESCO)，山羊血清，兔抗大鼠心肌肌鈣蛋白T(cTnT)單克隆抗體，FITC標記的山羊抗兔IgG;PCR引物(Takara公司)，Cpn PCR試劑盒(批號980316，廣東老年醫學研究所中心實驗室)。

1.2 BMSCs的分離與培養 采用貼壁培養和密度梯度離心結合法，取雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下取雙側股骨、脛骨，適量D-Hank液沖洗骨髓，100目篩網過濾，采用Percoll分離液(密度1.073 g/ml)，行密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，用L-DMEM離心洗滌2次(800 r/min，5 min)。以3.0×105個/cm2的密度接種于完全培養液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中繼續培養，48 h后首次換液，以后每3天更換一次培養液。2 w后，細胞80%長滿瓶底。待細胞融合至80%～90%，加入0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化細胞，按1∶3傳代接種于75 cm2培養瓶內，待細胞鋪滿瓶底后依上法傳代。

1.3 BMSCs的鑒定與標記 選用第三代MSCs，用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)法檢測細胞表面抗原CD44和CD34。將第5～6代的 MSCs用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1 μg/ml)標記2 h，用D-Hank液漂洗10次后，在熒光顯微鏡下用紫外光激發(激發波長340～380 nm)，觀察標記效果。

1.4 心肌細胞的分離與培養 于無菌操作下，開胸取出雄性Wistar大鼠心臟(留心尖部)，于4℃的D-Hank液中漂洗3～4次，將心尖部組織剪成1 mm3碎塊，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒溫水浴箱中消化3 min，棄上清。向剩余沉淀中加入混合消化液5 ml(0.0625%胰蛋白酶+0.1%Ⅱ型膠原酶)，置37℃水浴消化8～10 min，其間振蕩2～3次，靜置后將上清液移入離心管中，加含10%胎牛血清預冷的DMEM/F12培養液終止消化。重復上述方法消化7～8次，至組織塊基本消化完畢。收集各次上清液并終止消化后，用200目的尼龍網篩過濾去除殘留組織塊，以1000 r/min速度離心8 min，將所得的細胞與培養液混懸后，采用差速貼壁分離法去除心肌成纖維細胞每次2 h，吸出心肌細胞懸液，調整細胞密度接種于培養板中。培養前3 d加入0.1 mmol/L BrdU抑制成纖維細胞生長。48 h首次換液，以后根據情況2～3 d換液。

1.5 實驗分組 直接接觸共培養組:把心肌細胞和DAPIMSCs以40∶1比例混合后，按適當密度接種于含胎牛血清的DMEM培養液的培養板內。間接接觸共培養組:應用transwell培養板建立細胞間接共培養體系，上層接種原代培養的心肌細胞心肌細胞，下層接種DAPI-MSCs。兩種細胞以與直接接觸共培養組相同密度加入此體系中培養。兩組間分開培養，待各自貼壁后更換新的含血清DMEM培養基置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養箱中進行間接接觸共培養。

1.6 測定指標

1.6.1 免疫熒光檢測 培養2 w后將培養板底部的蓋玻片取出，PBS清洗，用95%的乙醇固定20 min，PBS清洗3次后，0.3%Triton室溫下細胞膜打孔20 min，用山羊血清封閉，滴加一抗(兔抗大鼠心肌肌鈣蛋白T單克隆抗體)，4℃過夜后，滴加二抗(FITC標記的山羊抗兔IgG)于室溫1～3 h行TroponinT免疫熒光染色，以檢測BMSCs分化為心肌樣細胞時cTnT在胞質中的表達。采用免疫熒光雙染色技術MSCs的細胞核經DAPI標記后的MSCs在紫外光激發下胞核呈藍色熒光，用共聚焦顯微鏡將“DAPI”與“FTIC”圖像合成。若觀察到雙陽性細胞即胞核呈藍色熒光、胞質呈綠色熒光，則提示BMSCs向CM發生了定向分化。

1.6.2 心肌細胞轉化率計算 觀察干預后MSCs的定向誘導情況，用免疫熒光方法標記cTnT。倒置相差顯微鏡，視野(×200)隨機取4個視野，直接接觸組計算cTnT綠色熒光蛋白雙陽性細胞數占綠色熒光蛋白陽性的比例;間接接觸組計算cTnT陽性細胞數占總細胞數的比率。

1.6.3實時熒光定量(RT-PCR)檢測細胞cTnTmRNA表達采用Trizol試劑提取細胞總RNA測定OD值，計算總RNA純度，按RT-PCR試劑盒進行逆轉錄制備cDNA。反轉錄反應條件:70℃5min，42℃60min，70℃10min，終止反應。反應參數為94℃30s，60℃30s，72℃30s，共32個循環后，再于72℃延伸7min。cTnT上游引物:5＇-GGCAGCGGAAGAGGATGCTGAA-3＇;下游引物:5＇-GAGGCACCAAGTTGGGCATGAACGA-3＇;GAPDH上游引物:5＇GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3＇;下游引物:5＇-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3＇。β-actin反應條件為:94℃5min預變性后，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共28個循環后，再于72℃延伸7min。總反應體系為50μl，包括cDNA3μl，1mmol/LdNTPs10μl，10×Taq聚合酶緩沖液5μl，目的基因和β-actin上下游引物各2μl(10pmol/L)，Mg2+3μl，去離子水24μl，Taq酶1μl。所得CT值經轉換后以2-△△CT相對定量法獲得每個樣本各目的基因相對表達量數值。

1.7 統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析，兩者比較方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett T3檢驗。

2 結果

2.1 BMSCs的形態學觀察及鑒定 BMSCs原代培養24 h后出現貼壁細胞，呈紡錘狀的成纖維細胞樣外觀。3 d后，細始呈集落樣生長，增殖明顯，呈現多種形態，主要為成纖維細胞樣，細胞呈梭形或星形，體積較小，隨著繼續培養，細胞體積增大，約14 d后可鋪滿瓶底。經傳代的BMSCs在24 h內完全貼壁，呈長梭形;3 d后，細胞體積較原代細胞明顯增大，多呈扁平狀、多角形，胞核清晰呈卵圓形，可見較多雙核細胞存在，提示細胞處于分裂狀態。7 d后細胞基本鋪滿瓶底，細胞間隙變小，細胞排列無明顯方向性。隨著傳代，細胞得到純化，梭形細胞達到95%以上(圖1)。經DAPI標記后，細胞核在熒光激發下通過顯微鏡觀察發藍光，計數細胞陽性率為100%。BMSCs免疫細胞化學染色結果顯示CD44呈陽性表達，CD34呈陰性表達，陽性細胞胞質內含棕黃色、顆粒狀物質(圖2)。

圖1 BMSCs原代培養形態學觀察(×100)

2.2 心肌細胞的形態學觀察及鑒定 剛分離的心肌細胞呈圓形，培養2 h后成纖維細胞基本完全貼壁，而少數心肌細胞8 h左右開始貼壁，少數貼壁的單個心肌細胞出現了自發性搏動，搏動的頻率、節律各不同。24 h后搏動的心肌細胞百分率大約為50%，搏動頻率較分散，約30～50次/min。至48 h視野下細胞呈梭形，板形，三角形或扁平不規則形，折光度較高，細胞中隱約可見細胞核，搏動的心肌細胞百分率大于90%，搏動頻率多集中在50～80次/min，72 h后細胞充分鋪展，貼壁牢固，少數局部呈均一搏動頻率，可達80～100次/min(圖3)。在免疫熒光染色時一抗選用羊抗大鼠心肌特異性cTnT的單克隆抗體，二抗選用FITC標記的山羊抗小鼠IgG，觀察到心肌細胞中胞質呈綠色熒光，即顯示心肌cTnT在胞質中已表達(圖3)。

圖2 BMSCs CD34、CD44表達(×400)

圖3 心肌細胞形態學觀察及鑒定

2.3 共培養后BMSCs形態學觀察 BMSCs與心肌細胞直接接觸共培養后，形態發生明顯變化，倒置相差顯微鏡下觀察可見與心肌細胞直接接觸的梭形BMSCs逐漸縮短，胞體稍增粗。BMSCs與心肌細胞間接接觸共培養后，BMSCs體積增大，梭形形態逐漸變短變粗，近似棒狀或橢圓形，細胞之間彼此靠近并出現連接，排列方向趨于一致。

2.4 共培養后BMSCs免疫熒光檢測及分化率計算 BMSCs分化為心肌樣細胞時心肌cTnT免疫熒光染色呈陽性，細胞分化率分析顯示，直接接觸共培養組與間接接觸共培養組中cTnT均表達，直接接觸共培養組分化率為22.42%±9.97%，間接接觸組分化率為4.81%±2.52%，其中間接接觸共培養組的分化率明顯低于直接接觸共培養組。RT-PCR檢測細胞cTnT mRNA的表達，OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍內，RNA純度較高。觀察電泳結果出現28S、18S和5S三條帶，確定RNA有較好的完整性。

3 討論

BMSCs以強大的自我更新能力和分化潛能成為多系統疾病細胞替代治療研究熱點，成為心肌梗死治療較為理想的細胞來源，為進行細胞移植治療心肌梗死疾病開辟全新的治療策略。以往實驗中單純藥物刺激難以模擬體內微環境，體內移植實驗又很難區分細胞融合還是細胞分化，因此近年來許多研究工作者采用共培(co-culture)的方法模擬體內微環境，研究BMSCs的分化可塑性〔5，6〕。BMSCs向特定細胞分化的能力受局部微環境的調控，在體外通過成體干細胞目的細胞共培養能在一定程度上“再現”體內微環境并成功誘導干細胞定向分化〔7〕。

本實驗直接培養組中，將BMSCs與心肌細胞混勻直接培養;間接培養組中，利用Transwell小室建立體外微環境誘導BMSCs向心肌樣細胞分化。Transwell小室，是一個可放置在孔板里的小杯子，杯底層有一張通透性的半透膜，此膜能夠阻隔細胞，允許培養液及細胞代謝物自由通過。實驗利用免疫熒光和自動化程度高且特異性更強的RT-PCR技術檢測BMSCs分化為心肌樣細胞時cTnT在胞質中的表達，cTnT是心肌細胞中特異性的結構蛋白，僅在心肌細胞中表現，是用來鑒定心肌細胞的重要指標〔8，9〕。本實驗結果顯示，直接接觸組的cTnT表達率明顯優于間接接觸組，直接接觸共培養BMSCs向心肌細胞的分化率優于間接接觸組。

本實驗兩個實驗組的區別是構建的心肌微環境的不同，出現不同結果的原因是模擬心肌微環境對于BMSCs的分化作用的影響不同。目前研究顯示，細胞間接觸及通話是器官發生、胚胎發生的關鍵因素，微環境對干細胞分化成其他細胞發揮著重要作用。干細胞進入體內不同器官能在不同的環境及生長因子作用下發生定向分化，微環境是誘導干細胞分化的關鍵因素。在體外通過成體干細胞與目的細胞共培養能在一定程度上“再現”體內微環境并成功誘導干細胞定向分化。共同培養的微環境中存在著很多影響因素，機械因素和化學因素(心肌細胞分泌的一些細胞因子和可溶性的化學物質)〔10〕，BMSCs修復受損心肌的能力可能是多途徑共同作用的結果，而不是通過單一途徑實現的。

雖然體外微環境對于BMSCs心肌樣分化的影響因素可歸結為化學和物理刺激，但這些因素及其作用機制錯綜復雜，目前尚未有定論，極大地限制了心肌微環境對干細胞向心肌細胞分化的影響的研究發展。未來，將近一步深入與完善心肌微環境對BMSCs向心肌細胞分化的影響及其機制的研究。

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〔2013-12-09修回〕