胰腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的篩選及信號(hào)通路

于 威 柳長明 張 凱 葉 飛 張 泳 王瑛韜

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，吉林 長春 130033)

胰腺癌早期診斷困難，惡性程度高，手術(shù)切除率低，預(yù)后極差。近年來隨著各種治療技術(shù)和診斷方法的發(fā)展，腫瘤的診斷率和生存率正在逐年提高，但胰腺癌的預(yù)后仍然很差。因此，對(duì)于胰腺癌分子機(jī)制的研究，特別是尋找胰腺癌診斷和治療的靶點(diǎn)及與胰腺癌調(diào)控相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 本研究中使用的標(biāo)本來自美國西奈山醫(yī)學(xué)中心(Mount Sinai Medical center)組織標(biāo)本庫，其中胰腺癌組織標(biāo)本16個(gè)，正常胰腺組織標(biāo)本13個(gè)。在16個(gè)胰腺癌組織標(biāo)本中男9例，女7例;年齡﹥60歲的12例，≤60歲的4例，中位年齡66歲;高加索人種的標(biāo)本9例，非高加索人種的標(biāo)本7例;有淋巴轉(zhuǎn)移且為N1的11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的5例。本研究得到了西奈山醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 差異蛋白質(zhì)篩選 取胰腺癌及正常胰腺組織標(biāo)本3×3×5 mm3大小，加入1 ml裂解液，4℃，14000 r/min離心 30 min，提取總蛋白。二奎啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce公司，美國Rockford)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。每孔加入300 μg蛋白質(zhì)，10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)至硝化纖維膜上。將硝化纖維膜以5%的牛奶在室溫下封閉1 h。將硝化纖維膜固定在免疫印跡雜交盒內(nèi)，雜交盒有20條雜交道，每條雜交道可加1～2種一抗，抗體結(jié)合到蛋白質(zhì)上，4℃孵育過夜。清晰印記后，與二抗在室溫下雜交1 h。清洗硝化纖維膜后加入化學(xué)發(fā)光液。用凝膠成像系統(tǒng)拍攝化學(xué)發(fā)光信號(hào)。用光密度掃描系統(tǒng)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并且使用內(nèi)參確定測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。采用t檢驗(yàn)確定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)。

1.3 信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析 為了進(jìn)一步探求試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)(http://www.ingenuity.com)。將pathway array方法找到的差異蛋白輸入IPA，進(jìn)而確定與這些蛋白質(zhì)相關(guān)的經(jīng)典細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路及生物學(xué)功能。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織與正常胰腺組織間差異蛋白的表達(dá)情況 采用pathway array法共檢測(cè)了143種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。把硝酸纖維素膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光并用ChemiDocTMXRS型凝膠成像儀進(jìn)行拍照，得到圖像，最后將圖像用Quantity One 4.5.0(Bio-Rad)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)分析后的結(jié)果顯示有12個(gè)蛋白在胰腺癌組織和正常組織間存在差異表達(dá)的情況(P ＜0.05)，其中8 個(gè)蛋白(FAS，cdk2，cdc2 p34，EGFR，Akt，Vimentin，E-cadherin，ICAM-1)在胰腺癌組織中高表達(dá)，4個(gè)蛋白(cyclin B1，Cdc25B，H-Ras，HIF-3α)在胰腺癌組織中低表達(dá)。見圖1。

圖1 胰腺癌組織與正常胰腺組織間的12種蛋白

2.2 與胰腺癌相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路 把篩選出的在胰腺癌與胰腺正常組織中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的12個(gè)差異表達(dá)蛋白的數(shù)據(jù)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后輸入IPA系統(tǒng)，得出這些蛋白質(zhì)參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終確定了10條與胰腺癌相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。包括細(xì)胞周期信號(hào)通路:G2/M DNA Damage Checkpoint Regulation(CDC25B，CCNB1，CDK1);ATM 信號(hào)通路(CCNB1，CDK1，CDK2);ERK5信號(hào)通路(AKT1，HRAS，EGFR);細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期調(diào)控(CCNB1，CDK1，CDK2);細(xì)胞凋亡信號(hào)通路(HRAS，CDK1，F(xiàn)AS);FAK 信號(hào)通路(AKT1，HRAS，EGFR);p53信號(hào)通路(AKT1，F(xiàn)AS，CDK2);NF-κB 信號(hào)通路(AKT1，HRAS，EGFR);EGF信號(hào)通路(HRAS，EGFR);PI3K/AKT信號(hào)通路(AKT1，HRAS)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展源自基因的改變，基因的功能和調(diào)控都要通過蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，所以研究蛋白質(zhì)病理情況下的變化，更能從本質(zhì)上揭示疾病的發(fā)生和發(fā)展的過程。本研究共檢測(cè)出12個(gè)在胰腺癌組織和正常組織間存在差異表達(dá)的蛋白，這些蛋白與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長和增殖、組織形態(tài)學(xué)密切相關(guān)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)可能與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行討論。

細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)通過形成cyclin/cdks復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的高度有序運(yùn)行〔1〕。腫瘤是一類漸進(jìn)性細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞的疾病，細(xì)胞周期調(diào)控的異常與腫瘤密切相關(guān)，異常表達(dá)的cyclin、cdks，檢查點(diǎn)的異常都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞增殖失控，發(fā)生癌變。在本研究中cdk2和cdc2 p34在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，證明cdk2和cdc2 p34通過調(diào)控細(xì)胞周期在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起作用。

表皮生長因子(EGF)受體(EGFR)是由1186個(gè)氨基酸組成的單鏈跨膜蛋白，對(duì)EGF或轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)α具有高度親和性，二者特異性結(jié)合后激活酪氨酸激酶，促發(fā)細(xì)胞分裂信號(hào)，引起細(xì)胞增殖。現(xiàn)有的研究已經(jīng)證明EGFR蛋白的過表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，EGFR的過度活化與細(xì)胞增殖、腫瘤生長緊密相關(guān)〔2〕。

蛋白激酶B(Akt)是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡/存活的胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有Akt/PKB基因的擴(kuò)增和Akt的持續(xù)高度活化，而且Akt的異常表達(dá)與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)放化療耐受性密切相關(guān)。本研究提示PI3K/Akt信號(hào)通路被異常激活，進(jìn)而在腫瘤的增殖、存活、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、抵抗凋亡、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用〔3〕。因此，抑制Akt及PI3K/Akt信號(hào)通路有望成為治療腫瘤的途徑之一。

細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1是體內(nèi)重要的細(xì)胞活性分子，不僅參與了機(jī)體免疫過程及炎癥反應(yīng)，而且還通過與其相應(yīng)配體的結(jié)合，介導(dǎo)癌細(xì)胞與不同細(xì)胞、基質(zhì)的黏附，最終使癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，利于侵襲轉(zhuǎn)移〔4〕。細(xì)胞黏附分子在炎癥組織或惡性腫瘤中過表達(dá)可促使白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，增加了與周圍外環(huán)境的密切接觸，有利于腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移〔5〕。

1 Oakes V，Wang W，Harrington B，et al.Cyclin A/Cdk2 regulates Cdh1 and claspin during late S/G2phase of the cell cycle〔J〕.Cell Cycle，2014;13(20):3302-11.

2 Perini MV，Montagnini AL，Coudry R，et al.Prognostic significance of epidermal growth factor receptor overexpression in pancreas cancer and nodal metastasis〔J〕.ANZ J Surg，2015;85(3):174-8.

3 Watanabe S，Sato K，Okazaki Y，et al.Activation of PI3K-AKT pathway in oral epithelial dysplasia and early cancer of tongue〔J〕.Bull Tokyo Dent Coll，2009;50(3):125-33.

4 Sawada T，Kimura K，Nishihara T，et al.TGF-beta1 down-regulates ICAM-1 expression and enhances liver metastasis of pancreatic cancer〔J〕.Adv Med Sci，2006;51:60-5.

5 Sun JJ，Zhou XD，Liu YK，et al.Invasion and metastasis of liver cancer:expression of intercellular adhesion molecule 1〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，1999;125(1):28-34.

〔2015-04-22修回〕