茵陳蒿湯對梗阻性黃疸大鼠多藥耐藥相關蛋白表達的影響及意義

李曉峰 于 昆 戴 勇 秦 偉 楊生虎 黨寶寶 韓 云 楊立平 董 晉

(青海大學附屬醫院腹部腔鏡外科，青海 西寧 810000)

膽紅素主要因子多藥耐藥相關蛋白2(MRP2)基因是近年來新發現的三磷酸腺苷結合運載體家族成員，其主要表達于肝細胞基底膜并與膽紅素分泌密切相關〔1〕。MRP2基因的缺失和突變可造成血液中結合膽紅素大量堆積，誘發膽紅素代謝障礙并導致肝細胞損傷。茵陳蒿湯是中醫治療黃疸的經典方劑，具有顯著的保肝作用，但其作用機制尚未明確。本研究旨在為茵陳蒿湯治療梗阻性黃疸(OJ)提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡清潔級雄性SD大鼠50只，來源于中國科學院嚙齒類動物中心上海分中心，第3代，購于青海省地方病預防控制所，平均體重(201±18.75)g，飼養于青海大學附屬醫院動物實驗室，單籠喂養，室內溫度19℃ ～23℃。

1.2 材料 取茵陳蒿湯(茵陳30 g、梔子15 g、大黃10 g)，采用中藥煎制濃縮法:水煎法，每次均先武火后文火煎煮，上藥加水10倍量，浸泡2 h，煎煮30 min，濾過取汁，藥渣加水8倍量，煎煮1 h，濾過取汁，合煎煮30 min，濾過取汁，藥渣加水8倍量，煎煮1 h，濾過取汁，合并2次藥汁混合，過濾，濃縮為120 ml，4℃保存備用。

主要試劑:Tripure試劑(美國SIGMA公司)，MRP2一抗〔兔抗鼠多克隆抗體血清(EAG15)，免疫熒光檢查時稀釋為1∶200〕，RTPCR 試劑盒(PRO-megaCompany)，MRP2 擴增的上下游引物、內參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)擴增的上下游引物(上海基康公司)，正常山羊血清、焦碳酸二乙酯(DEPC)水、FTI℃山羊抗兔熒光二抗(武漢博士德生物有限公司)，丙酮異丙醇、氯仿、石蠟等(上海化學試劑公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組 將50只大鼠按照隨機化原則，隨機抽出10只作為假手術(SHAM)組，其余40只作為OJ組，造模后將OJ組隨即平均分為OJ實驗組和OJ對照組。所有SD大鼠均給予普通飼料喂養。按動物體表面積比率換算等效劑量法計算出予以中藥的劑量，OJ實驗組大鼠給予1 ml/100 g茵陳蒿湯灌胃，OJ對照組大鼠用生理鹽水以同樣方法灌胃，持續用藥2 w。

1.3.2 OJ模型的建立 OJ組大鼠以25%烏拉坦溶液行腹腔內注射麻醉，麻醉成功后，行大鼠腹部皮膚常規消毒，取腹部正中切口，暴露膽總管，距其起始部位0.5 cm處游離膽總管，以3-0號線雙重結扎并切斷，關腹。假手術組僅游離膽總管，不作結扎處理。術后8～12 h后口飼補液，1 d后自由進食，保證充足飲水。

1.3.3 標本的采集與處理 25%烏拉坦溶液按1 g/kg腹腔內注射麻醉，麻醉成功后，取腹部正中切口打開腹腔，觀察大體形態，肝臟的色質，清除大鼠自然生長而產生的差異。開腹后經下腔靜脈采血3～5 ml，冰浴，離心15 min(4℃，3000 r/min)，取上清置于－70℃保存待測;摘取肝臟后，從肝右葉切取1.0×0.8×0.3 cm3大小肝組織，置10%甲醛固定，逐級梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.3.4 血樣采集及保存 將大鼠麻醉后，腹主動脈采血約4～5 ml，二鉀鹽抗凝管離心后取血漿，超低溫冰箱－70℃保存。生化分析儀檢測血清谷草轉氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TB)、總膽汁酸(TBA)。

1.3.5 肝組織MRP2轉運蛋白檢測 (1)石蠟保存的肝臟標本行4 μm 厚切片(先 10 μm 粗切，后 4 μm 細切)，載玻片撈片;(2)切片脫蠟水化:二甲苯脫水各5 min，無水酒精、95%、90%、80%酒精依次梯度脫水5 min;(3)室溫放置30 min，用20℃丙酮固定10 min，自然風干;(4)用緩沖液沖洗，5 min×3次，每間隔5 min/次;(5)先封閉，用正常山羊血清磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，室溫孵育20 min，棄去血清，置于室溫編號入濕盒;(6)以正常山羊血清PBS、一抗(1∶200)稀釋液封閉，4℃孵育冰箱過夜;(7)次日用PBS沖洗，5 min×3次，未結合的抗體用0.01 mol/L，pH7.2的PBS輕震蕩洗滌，10 min×2次;(8)以下步驟避光，加封閉液稀釋的山羊抗兔熒光二抗，室溫下孵育30～60 min;(9)PBS沖洗，5 min×3次，最后用蒸餾水沖洗1次，自然風干;(10)甘油PBS封片，鏡檢;(11)CMIA圖像分析儀測定MRP2表達以相對灰度值表示。陽性判定標準:深黃色或棕黃色為強陽性()，黃色為陽性()，淺黃色為弱陽性(+)，與背景同色者為陰性(-)。用醫學圖文系統分析，每張切片隨機選取5個視野，測定MRP2陽性纖維的平均光密度，灰度值越大，表示MRP2的含量越高。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結果

2.1 OJ大鼠肝臟病理學變化 OJ組大鼠肝血管充血，肝細胞腫脹，氣球樣變性，出現點狀壞死，肝內膽管擴張，小葉周邊可見新生小膽管樣上皮細胞，以匯管區明顯，有少量炎性細胞浸潤。SHAM組病變較輕，未見明顯差異。見圖1。

2.2 茵陳蒿湯對OJ大鼠肝功能的影響 OJ實驗組和OJ對照組中 AST、ALB、TB、TBA 均明顯高于 SHAM 組(P＜0.05);而OJ實驗組各指標均顯著低于OJ對照組(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠肝臟病理學改變

表1 各組肝功能檢查結果比較(±s，U/L)

表1 各組肝功能檢查結果比較(±s，U/L)

與SHAM組比較:1)P＜0.05;與OJ實驗組比較:2)P＜0.05

16 OJ實驗組 20589.34±60.481) 15.16±2.161) 628.67±68.451) 691.56±30.821)OJ對照組 20736.52±40.821)2) 19.28±1.561)2) 765.35±32.691)2) 779.32±49.231)2)AST ALB TB TBA SHAM組 1031.52±3.128.02±1.5319.26±2.9415.06±2.組別 n

2.3 茵陳蒿湯對OJ大鼠肝組織MRP2蛋白表達陽性率的影響OJ實驗組和OJ對照組肝組織MRP2的表達陽性率顯著低于SHAM組(100%，+20%，30%，50%);而OJ實驗組肝組織MRP2的表達陽性率(50%，+40%，10%)顯著高于OJ對照組(30%，均為+)(P＜0.05)。

3 討論

膽汁的形成、分泌和排泄機制非常復雜，膽汁酸是膽汁中的一種以K鹽和Na鹽的形式存在的膽烷酸。膽汁酸主要由膽固醇轉化而來，在代謝過程中經過肝腸循環，在腸道有95%膽汁酸被重新吸收，經門靜脈血流入肝臟，正常人體中的膽汁酸基本完全被肝臟攝取〔2〕。膽汁酸幾乎是唯一可同時反映肝細胞合成功能及肝細胞損傷的血清學指標。正常人血中膽汁酸水平的升高必然導致肝細胞病變，在各種急慢性肝病中，膽汁酸的水平基本與病情表現保持平行。目前已知高膽汁酸血癥引發肝細胞損害的機制包括:(1)高膽汁酸與高膽紅素引發能量代謝改變，從而引發肝細胞損害;(2)OJ引起的代謝紊亂改變了正常肝臟的血流動力學，從而引起肝細胞受損;(3)OJ引起的高膽汁酸狀態影響了呼吸鏈電子的傳遞;(4)OJ引起的高膽汁酸狀態導致肝細胞內電解質Ca、Mg濃度變化，從而激發了蛋白激酶PKC導致細胞凋亡;(5)OJ的高膽汁酸作用導致肝臟KC細胞產生毒性作用，從而影響機體正常的免疫功能;(6)OJ的高膽汁酸引起腸源性內毒素血癥，從而導致肝細胞損傷〔3〕。MRP2通過對膽紅素與膽汁酸的調節，降低膽汁酸的水平，其可能機制是:(1)MRP2調節膽汁內一些具備生物活性的谷胱甘肽結合物以及葡萄糖醛酸與硫酸鹽結合物的分泌，結合體內的高膽汁酸，降低膽汁酸濃度，保護肝臟細胞。(2)MRP2參與調整體內膽汁酸的重新分布，將膽汁酸轉運到MRP2基因表達的細胞膜，起到類似屏障的作用。(3)MRP2調節膽汁分泌，從而保護肝細胞〔4〕。茵陳蒿湯是中醫治療黃疸的經典方劑，方由茵陳蒿、梔子、大黃三味藥組成，方中用茵陳清熱利濕，疏利肝膽為君;梔子清泄三焦濕熱，并可退黃為臣;大黃通利大便，導熱下行為佐，三藥相配，使濕熱之邪從二便排泄，濕去熱除，則發黃自退〔5〕。現代藥理學研究證實，茵陳蒿湯能維持肝細胞膜系統的穩定，中和可溶性細胞因子，防止肝臟細胞的纖維化和壞死，清除自由基，預防超氧化物陰離子引起的成纖維細胞的損傷，清除體內內毒素的自由基，降低血清內毒素水平，保護肝細胞膜，預防肝細胞壞死，促進肝細胞再生及保障肝細胞微循環，誘導肝臟酶系統對膽紅素的攝取，松弛膽道括約肌，增加膽汁流量，加速膽汁排泄〔6〕。本實驗結果提示OJ中存在膽汁酸代謝紊亂和肝細胞損害，而茵陳蒿湯灌胃處理可起到有效的保肝作用，降低OJ所致的膽汁酸代謝紊亂和肝細胞損害;并且，MRP2可能是通過調節膽汁酸代謝參與OJ發生與發展，而調節MRP2表達可能是茵陳蒿湯發揮治療作用的主要機制。

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5 劉 瑩，張會存，段 娜，等.茵陳蒿湯對高脂飲食誘導大鼠非酒精性脂肪性肝炎的藥效學觀察〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012;18(13):217-9.

6 徐國萍，白 娟，舒靜娜，等.茵陳蒿湯的藥理研究進展〔J〕.浙江中西醫結合雜志，2011;21(1):64-7.