富硒板黨對D-半乳糖所致衰老小鼠模型的影響

詹光杰 楊年安(湖北民族學院醫學院，湖北 恩施 445000)

富硒板黨(BCPA)因出產于有“中國硒都”之稱的湖北恩施板橋境內而得名。1981年在全國藥材品種質量鑒定會上定名為“中國板黨”，簡稱“板黨”。BCPA富含多種甾醇、多糖、皂甙、多種氨基酸和微量元素，有清除體內活性氧，減少丙二醛(MDA)產生，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力等藥理作用〔1，2〕。本研究采用D-半乳糖誘導致亞急性衰老小鼠模型，分別注射不同劑量BCPA注射液，觀察BCPA對衰老小鼠學習記憶的影響，并從氧化應激方面探討BCPA抗衰老作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠(雌雄各半)，5～7周齡，體重(22.3±3.2)g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，常規飼養。

1.2 藥品與儀器 D-半乳糖(Sigma公司)，IL-2、IL-6 ELISA試劑盒(晶美公司)，MDA、LP、GSH-Px、SOD 及羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物制品研究所)，其他化學試劑為國產分析純試劑(湖北恩施樂之塬科技公司)。FA1640電子天平(上海天平儀器廠)，電動玻璃勻漿機(寧波新芝科技股份有限公司)，全自動酶標儀(美國 Thermo公司)，紫外分光光度儀(美國Beckman公司)，DMS-2 Morris水迷宮系統(中國醫學科學院藥物研究所)。

1.3 BCPA注射液 購自恩施板橋鄉中藥材生產質量管理規范(GAP)示范基地，采用水提醇沉法制成含生藥30%(相當于生藥含量2 g/ml)的液體，瓶裝密封消毒貯存于4℃備用，用時以生理鹽水稀釋成0.4 g/ml。

1.4 動物分組、造模及給藥 將昆明種小鼠(雌雄各半)40只，隨機分為正常組、模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組，每組8只。模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組每天按500 mg/kg腹腔注射D-半乳糖〔3〕，正常組腹腔注射相等量生理鹽水。高劑量組、中劑量組及低劑量組在注射D-半乳糖的同時每天腹腔按7.2、3.6及1.8 g/kg注射BCPA，模型組、正常組注射等量生理鹽水。各組自由進食、飲水，常規飼養連續50 d。

1.5 Morris水迷宮實驗 從造模給藥第40天起，參照Morris水迷宮實驗方法測量小鼠學習和記憶能力〔4，5〕。每天注射后進行訓練，上下午各1次，歷時10 d。水迷宮為通用型，圓形桶，直徑180 cm、高50 cm，水池內壁涂為黑色，水深30 cm，水溫控制在22℃ ～24℃。在水池壁邊沿平均分為四個不同的標記，把水池分為一、二、三、四個象限，選第三象限正中放置高度為28 cm，直徑8 cm的平臺，沒入水下2 cm。將小鼠面向池壁，依次由第一、二、三、四象限入水點放入水中，記錄120 s內找到平臺的時間(逃避潛伏期)，如120 s內未能找到平臺，由實驗者將其引至上面停留10 s，再放回籠中，逃避潛伏期記為120 s。第9天最后1次訓練后撤除水下平臺，第10天在同一入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在120 s內跨越原平臺相應位置的次數，以衡量小鼠對水迷宮記憶的獲取能力。

1.6 小鼠皮膚羥脯氨酸及腦組織MDA、脂褐質(LP)、SOD及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的檢測 水迷宮訓練結束后，分別取各組小鼠背部皮膚約1 cm2，去毛及脂肪，用1∶1丙酮-乙醚脫脂，切碎晾干，精密稱取30 mg，按試劑盒說明書進行羥脯氨酸含量的測定。然后處死小鼠，取小鼠腦組織放入冰凍生理鹽水(0.9%)沖洗拭干，迅速用精密分析天平稱取重量后剪碎，制備成10%勻漿，離心后取上清。按照試劑盒說明書分別進行組織MDA、LP、SOD及GSH-Px的檢測，并用紫外分光光度計測定出結果。

1.7 ELISA法檢測BCPA對小鼠血清中白細胞介素(IL)-2及IL-6的影響 小心收集小鼠血清于無內毒素、熱原的試管中，及時處理或貯存在－70℃冰箱。檢測采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附(ELISA)法，具體步驟參考試劑盒說明書。

2 結果

2.1 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空間探索的影響 模型組小鼠找到平臺的潛伏期長。BCPA各組潛伏期與模型組相比較均有明顯減少(P＜0.05)。在空間探索實驗中，模型組小鼠穿越平臺的次數比其他各組小鼠的次數少(P＜0.05)。見表1。

2.2 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織勻漿的抗氧化作用 對照組及BCPA各組組織勻漿MDA與LP含量均低于模型組(P＜0.05)。對照組及BCPA各組組織勻漿中SOD與GSH-Px的活性明顯高于模型組(P＜0.05)。高劑量與低劑量BCPA組的MDA與LP含量要低于低劑量BCPA組，而其SOD與GSH-Px活性高于低劑量BCPA組(P＜0.05)。見表2。

2.4 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠皮膚羥脯氨酸含量的影響 模型組、BCPA低、中、高劑量組小鼠皮膚羥脯氨酸含量分別為(7.48±2.67)、(9.83±1.34)、(10.27±1.52)、(11.54±2.35)μg/ml，注射D-半乳糖各組小鼠皮膚羥脯氨酸含量都明顯低于對照組〔(14.32±2.85)μg/ml，P ＜0.05〕，然而 BCPA 各組小鼠皮膚中羥脯氨酸的含量明顯高于模型組(P＜0.05)。

2.3 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠各組血清中IL-2、IL-6含量的影響 見表2。各BCPA組小鼠血清中IL-2、IL-6含量顯著高于對照組和模型組(P＜0.05)，模型組小鼠血清中IL-2、IL-6比對照組要低(P＜0.05)。

表1 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空間探索的影響(±s，n=8)

表1 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空間探索的影響(±s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 平均潛伏期(s) 穿越原平臺次數(次)BCPA低劑量組 54.65±11.1211) 3.87±1.2411)BCPA中劑量組 52.32±10.4511) 4.12±1.4311)BCPA高劑量組 50.12±9.8711) 4.36±1.0811)模型組 81.27±20.341.24±0.65對照組 46.76±11.351) 4.58±1.531)

表2 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織勻漿的抗氧化性作用及對小鼠血清IL-2、IL-6含量的影響(±s，n=8)

表2 BCPA對D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織勻漿的抗氧化性作用及對小鼠血清IL-2、IL-6含量的影響(±s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05，與BCPA低劑量組比較:2)P＜0.05

組別SOD(U/mg)MDA(mol/mg)LP(μg/mg)GSH-Px(U/g)IL-2(pg/ml)IL-6(ng/L)BCPA低劑量組 155.36±10.4211) 9.36±0.5211) 65.42±1.8811) 67.31±1.6511) 90.13±4.091) 123.16±3.671)BCPA中劑量組 187.34±8.3121)2) 8.57±0.9121)2) 58.51±1.3421)2) 70.35±3.1821)2) 105.34±4.251) 142.08±3.531)2)BCPA高劑量組 195.21±9.1421)2) 7.24±0.8421)2) 51.57±1.5821)2) 75.42±2.8321)2) 118.65±4.571)2) 164.23±3.451)2)模型組 121.47±9.7613.67±1.5677.32±1.7655.13±3.2532.78±2.952) 53.87±2.742)對照組 184.28±7.5811) 9.04±0.4511) 57.62±2.4511) 64.57±4.4711) 57.82±3.241)2) 96.54±3.081)2)

3 討論

本實驗是采用連續注射D-半乳糖在小鼠體內積累，使細胞內醛糖還原酶將其還原成不能正常代謝的半乳糖醇，而半乳糖醇一旦在體內堆積就會影響細胞的滲透壓，導致細胞腫脹、細胞功能障礙、代謝紊亂而致使機體衰老〔6〕。衰老是一種復雜的生命現象，機體在發育成熟后，體內各種生理功能進行性下降的過程。有關衰老的機制，科學家提出了多種假說，自由基學說就是其中之一。該學說主要觀點認為衰老是生命過程中代謝所產生的活性氧造成的損傷累積而引起的，抗氧化轉基因動物實驗證明了這一理論，過量表達SOD和過氧化氫酶的轉基因果蠅壽命得以延長〔7〕。過多的氧自由基會造成細胞膜的破壞，使蛋白質(酶)變性，并會導致一系列神經功能損傷，造成認知障礙，加速衰老。

衰老早期的認知受損主要表現在學習能力的下降及記憶障礙。本研究結果提示小鼠的空間定位能力、空間記憶能力等認知能力均出現了一定程度的損傷，BCPA對衰老過程中的認知障礙有較好的恢復作用。SOD在有機體內平衡氧化與抗氧化，清除超氧離子自由基，保護細胞;MDA則是通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，破壞生物膜中的不飽合脂肪酸，形成脂質過氧化物，導致細胞損傷;LP在細胞中的堆積會引起細胞免疫能力的下降，細胞功能受損，誘發衰老，如果在腦細胞中堆積則會引發學習記憶等認識障礙;GSH-Px可特異性還原GSH對過氧化氫的還原，清除有害過氧化物代謝產物，切斷脂質過氧化，保護細胞正常生理功能。本實驗提示不同劑量BCPA對D-半乳糖所致衰老模型小鼠的作用效果是不同的，本研究推測與BCPA注液中有效成分的含量有關。

羥脯氨酸本是膠原蛋白的組成成分，在機體衰老過程中，會因氧氣供給不足而影響脯氨酸的羥化作用，致使皮膚中羥脯氨酸的含量下降。本實驗結果表明，BCPA可以有效地恢復衰老小鼠皮膚中的羥脯氨酸的含量。

IL-2可維持細胞的增殖，刺激T細胞轉鐵蛋白受體、胰島素受體等抗原表達，誘導多種殺傷細胞的分化和效應功能。IL-6與IL-6受體結合后，在機體內有多種生物學活性，如可影響細胞生長，促進細胞分化等。在本實驗中BCPA能顯著增加小鼠體內的IL-2和IL-6的含量，提示BCPA能有效地增強衰老小鼠的免疫功能，有助于促進細胞的分裂增殖。

本研究結果表明BCPA的有效成分具有多種生物學活性，可以通過不同的通路發揮抗衰老作用，在改善學習記憶功能，清除體內自由基抗氧化，增強機體免疫能力等方面都有較好的作用，但BCPA抗衰老機制還有待于從分子水平進行研究。

1 肖本見，陳國棟，蘭宗平.富硒板黨地上部分對小鼠益智和低氧/復氧損傷的保護作用的研究〔J〕.中藥材，2005;28(8):688-90.

2 郭 美，劉麗莎，何 敏，等.黨參抗衰老作用的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(5):1205-7.

3 姜國良，于 曉，徐 愷，等.腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(5):1101-3.

4 王緒平，咼登俊，陳 宇，等.Morris水迷宮實驗評價血管性癡呆大鼠模型的學習記憶能力〔J〕.中華中醫藥學刊，2013;31(1):99-100.

5 劉金鳳，聶 坤，栗振杰，等.Morris水迷宮測評方法的改進及對快速老化癡呆小鼠SAMP8認知功能的再評價〔J〕.中國中醫急癥，2013;22(1):5-7.

6 Song X，Bao M，Li D.Advanced glycation in D-galactose induced mouseaging model〔J〕.Mech Ageing Dev，1999;108(3):239-51.

7 李 燕.銀耳多糖的抗衰老作用及其機制研究〔D〕.上海:第二軍醫大學，2004.