水稻白葉枯病菌第二信使c-di-GMP代謝酶基因的預測和分析

薛丁榕 田芳 李海云 楊鳳環(huán) 陳華民 何晨陽

水稻黃單胞水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白葉枯病是世界水稻生產(chǎn)上重要的細菌性病害之一［1］。由于經(jīng)濟重要性以及遺傳可操作性，水稻-Xoo互作已成為植物-病原物互作研究的模式系統(tǒng)之一［2］。隨著KACC10331（韓國菌株）、MAFF311018（日本菌株）和PXO99A（菲律賓菌株）全基因組測序的完成［3-5］，為深入研究Xoo致病性的信號調(diào)控機理奠定了基礎。

環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是一種存在廣泛的細菌小分子第二信使，調(diào)控了毒性、生物膜形成和運動性等諸多生物學功能［6-8］。含GGDEF結構域的鳥苷酸環(huán)化酶（DGC）和含EAL或HD-GYP 結構域的磷 酸二酯酶（PDE）分別控制了c-di-GMP的合成和降解［9］。GGDEF、EAL和HD-GYP結構域蛋白編碼基因在細菌基因組中廣泛存在，形成一個復雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡［10］。

本研究比較分析上述菌株中GGDEF、EAL和HD-GYP結構域蛋白的種類、數(shù)量及其序列特征，鑒別基序保守的DGC或PDE、基序退化的c-di-GMP信號受體。此外，發(fā)現(xiàn)感知外界環(huán)境信號、調(diào)控輸出結構域活性的信號輸入結構域，旨在為從Xoo中鑒定DGC和PDE編碼基因并研究其功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為PXO99A、MAFF311018和 KACC-10331，其核酸和氨基酸序列來源于NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000967.1，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_007705.1，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE013598.1）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白保守結構域的預測 利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和 MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/tools/meme）程序（參數(shù)設置motif寬度為最小3，最大50）預測蛋白保守結構域。

1.2.2 結構域蛋白基因的分布 運用CGView Server作圖，分析結構域蛋白基因在基因組的分布（參數(shù)設置為 blastx，expect = 0.0 0001，Bacterial and Plant Plastid，filter = yes，alignment_cutoff = 85，identity_cutoff = 85）。

1.2.3 系統(tǒng)進化分析 利用MEGA5構建系統(tǒng)進化樹［11］， 比 較 所 有 GGDEF、EAL和 HD-GYP結 構域蛋白的相似性；采用基于JTT矩陣基礎模型最大相似法［12］， 構建進化模型（bootstrap replication=1000）［13］。

1.2.4 基因功能驗證 基因功能驗證包括DGC/PDE酶活性、c-di-GMP結合作用以及細菌毒性相關表型等測定［14-17］。

2 結果

2.1 GGDEF、EAL和HD-GYP結構域蛋白基因的鑒定

PXO99A、MAFF311018和 KACC10331分 別 有26、26 和25個基因編碼了GGDEF、EAL和HDGYP結構域（表1）。PXO99A和MAFF311018基因數(shù)量和類型相同，而KACC10331則比前兩種菌株少一個GGDEF結構域基因（表1和表2）。

鑒定了幾個菌株特異的、只編碼GGDEF結構域基因（表2）。PXO99A獨有PXO_02615基因，但 缺 少 與 XOO2206（MAFF311018）和 XOO2330（KACC10331）同源的基因；KACC103 31缺少與PXO_04147（PXO99A）和 XOO3786（MAFF311018）同源的基因。

2.2 GGDEF、EAL和HD-GYP結構域蛋白的同源性分析

GGDEF、EAL和HD-GYP結構域蛋白基因分散于Xoo整個基因組中，但也存在一定的集聚（圖1）。同源蛋白具有高達90％以上的序列相似性，同組聚集在一個內(nèi)部節(jié)點上，如單獨GGDEF結構域聚集在藍區(qū)，單獨EAL結構域在綠區(qū)，GGDEF和EAL結構域雜合蛋白在黃區(qū)，HD-GYP結構域在紅區(qū)。所有這些GGDEF和EAL蛋白編碼基因分散在Xoo基因組各部分，但在1800-2 900 kb的位置相對集中（圖2）。結果表明，3個菌株尤其是MAFF311018菌株和KACC10331菌株在進化上的親緣關系很近。

2.3 DGC和PDE的預測和功能驗證

39％的GGDEF結構域含有GGEEF或GGDEF保守基序（其中GGEEF占62.5％），87％的含有EAL或EVL以及HD-GYP保守基序（表1和表2）。每個菌株有19個GGDEF、EAL和HD-GYP基序保守的蛋白，預測它們可能是有活性的DGC或PDE；其余退化的蛋白是c-di-GMP信號受體（表2）。

24％的GGDEF結構域蛋白具有DGC酶活性的保守結構，包括保守的GGDEF或GGEEF基序和I位點（RXXD基序）、GTP和Mg2+結合序列、GTP結合KXXXR保守序列（圖3）。PDE包含EAL和HD-GYP結構域蛋白兩種類型。

含EAL結構域的PDE具有對活性非常重要的EAL/E VL和DDFGTG保守基序；RocR的R179和Q161是c-di-GMP結合關鍵位點，而D295、N233、E265、E175、E352、E268、K316和 Q372是 Mg2+結合關鍵位點［18］，Mg2+為PDE活性所 必須。MEME分析（圖4）表明，Xoo存在 相同的保守位點。含HD-GYP結構域的PDE具有保守的HD和GYP殘基，中間間隔60或61位氨基酸，HD殘基對酶催化的影響非常關鍵。

表1 水稻白葉枯病菌c-di-GMP相關基因編碼的結構域

已經(jīng)驗證了部分不同結構域蛋白的生物學功能（表2）。GGDEF/EAL結構域保守的PXO_01019（PdeR）是具有c-di-GMP信號降解活性的PDE［14］；GGDEF/EAL結構域退化的Filp（PXO_0040 3）是c-di-GMP信 號 受 體［15］；EAL單 一 結 構 域 蛋 白PXO_04753（VieAxoo ）突變體生物膜形成明顯增多［16］；HD-GYP 結構域蛋白 PXO_00070（RpfCxoo）突變體毒性、EPS產(chǎn)生、生物膜形成能力等有顯著變化［17］。

2.4 信號輸入結構域的鑒定

信號輸入結構域通過感知外部環(huán)境信號變化，調(diào)節(jié)下游輸出結構域的活性。GGDEF、EAL和HDGYP蛋白具有多種信號接受結構域（表1）。19％的DGC和40％的PDE具有REC結構域，接收磷酸化信號［19］。24％的DGC和27％的PDE具有PAS結構域，能感應環(huán)境氧、光、氧化還原電位、小配基以及細胞總能級的變化［20］。10％的DGC和13％的PDE包含GAF結構域，與cGMP結合后能調(diào)節(jié)催化活性［21］。HAMP僅存在于GGDEF蛋白中，與配基結合后具有調(diào)節(jié)同源二聚體受體磷酸化和甲基化的作用［22］。3個同源蛋白（PXO_02019、XOO1324和 XOO1440）具有Cache_1結構域，參與細菌趨化性的小分子識別［23］。3個 同 源 蛋 白（PXO_01741、XOO1775和XOO1879）具有CHASE3結構域，涉及跨膜受體的信號接收［24］。

此外，11％的DGC和7％的PDE具有信號肽，48％的DGC和33％的PDE具有跨膜結構（表1），表明這些信號肽可以透過或者錨定在細胞膜上，發(fā)生 DGC 和 PDE 活性的調(diào)節(jié)［25，26］。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在Xoo中存在大量的c-di-GMP信號相關的基因，反映了其在細菌中具有重要的作用。其中一部分基因編碼了DGC和PDE代謝酶，控制了c-di-GMP的胞內(nèi)含量，另一部分結構域發(fā)生退化，可能編碼了受體或結合蛋白，與c-di-GMP信號分子結合后，進而調(diào)控細菌包括毒性、生物膜形成、EPS產(chǎn)生和運動性等在內(nèi)的諸多生物學功能。然而，c-di-GMP信號途徑是一個非常復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，可能存在反饋抑制c-di-GMP合成的調(diào)節(jié)作用。此外，它還與雙組份系統(tǒng)、群體感應信號系統(tǒng)等共同發(fā)揮作用，介導了下游的調(diào)控反應。

表2 水稻白葉枯病菌GGDEF、EAL和HD-GYP結構域的保守和變異的基序

在其它一些與Xoo近緣關系相近的黃單胞細菌中，c-di-GMP信號基因的功能已獲得了驗 證。橘黃單胞菌（X. citri subsp. citri）XAC0610（PXO_04155、XOO_3792和XOO_4021同源蛋白）具有DGC酶活性，雖然它并不具有GGDEF/GGEEF保守基序，但具有與Mg2+和GTP結合的保守位點［27］。水稻細菌性條斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）RpfG（PXO_00070、XOO_2236和XOO_2871的同源蛋白）和野油菜黃 單 胞 菌（X. campestris）RavR具 有 PDE酶 活性［28，29］。磷酸化后的RavR雜合結構域蛋白具有PDE活性，去磷酸化后具有DGC酶活性［30］，這更加說明c-di-GMP代謝調(diào)控網(wǎng)絡的復雜性。

另外，雖然已驗證Xoo四個GGDEF、EAL和HD-GYP 結構域蛋白的功能，但其它大多數(shù)的功能尚有待試驗分析。目前，正在對其余蛋白進行DGC/PDE活性、c-di-GMP結合作用以及細菌毒性相關表型等測定。

圖1 采用最大似然法構建水稻白葉枯病菌系統(tǒng)進化樹

4 結論

Xoo GGDEF、EAL和HD-GYP 結構域蛋白參與了c-di-GMP信號途徑，包括作為DGC或PDE合成或降解了c-di-GMP，或作為c-di-GMP信號受體調(diào)控了細菌生物學功能。此外，多數(shù)蛋白具有感知環(huán)境信號變化的輸入結構域，調(diào)控輸出結構域的活性。

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圖2 水稻白葉枯病菌c-di-GMP代謝相關基因在基因組的分布

圖3 MEME分析水稻白葉枯病菌DGC的保守序列

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圖4 MEME分析水稻白葉枯病菌PDE的保守序列

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