鹽角草高親和鉀離子轉運蛋白SeHKT1基因的克隆及表達分析

馬金彪 張大勇 張梅茹 肖薪龍 張選 李麗

鉀（K）、鈉（Na）是植物生長過程中重要的營養元素，對維持細胞的滲透壓、調節葉片和氣孔運動以及細胞伸長等具有重要作用［1］，K+/Na+比是衡量植物是否具有耐鹽特性的重要指標之一［2］，植物細胞質中的Na+是重要的毒性決定因子，在鹽漬條件下，過量Na+對植物是有害的［3］，大量的Na+會限制K+的吸收［4］，從而影響K+/ Na+比，因此保持細胞內相對較高的K+含量對植物的生長至關重要。HKT類蛋白是一種高親和鉀離子轉運載體，廣泛存在于植物、真菌、真細菌和古細菌中，對于維持生物體內K+/ Na+比具有重要作用［5］。

Schachtman等［6］從小麥中克隆得到第一個HKT基因，以后陸續在水稻、擬南芥、冰葉日中花、海篷子等多種植物中克隆了其同源蛋白基因。大量研究表明，HKT類蛋白根據其功能可以分為兩類，一種是以小麥TaHKT1、水稻OsHKT2、冰葉日中花McHKT1等為代表，為K+/Na+共轉運體，其對兩種離子具有高選擇性，當兩種離子都存在且Na+濃度較低時，同時轉運這兩種離子，是一種Na+偶聯的K+吸收載體，當K+濃度較低而Na+濃度較高時，介導低親和的Na+轉運而高親和K+吸收受到阻遏［7］，Su等［8］利用蛋白免疫定位技術發現McHKT1在葉片的液泡處有較強的表達信號，這一發現表明該蛋白在鹽生植物中起調節細胞質內離子平衡的作用；另一種則是以擬南芥為代表的AtHKT1蛋白，其主要在根中表達［9］，越來越多的證據表明HKT類蛋白不是作為一種高親和K+吸收載體在起作用，可能作為一種重要的Na+內流系統在起作用，且對Na+吸收起調控作用［10］。然而，目前對于HKT類蛋白在鹽生植物耐鹽特性上的機制仍然研究較少，本研究以鹽生植物鹽角草為材料，利用RACE技術克隆K+離子相關的轉運載體SeHKT1基因全長cDNA 序列，結合生物信息學方法分析其可能的跨膜特性和親和特性，且利用qRT-PCR技術對SeHKT1在不同脅迫條件下的表達情況進行初步分析，為在分子水平上揭示鹽生植物Na+、K+選擇性吸收、耐鹽機理及通過基因工程手段培育耐鹽作物新品種，改良鹽堿地提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽角草（Salicornia europaea L.）種子由中國科學院阜康荒漠生態站提供。

1.2 方法

1.2.1 材料的處理和培養 鹽角草種子播種于滅菌的蛭石培養基中，在溫室中培養，晝夜溫度為25℃/20℃，Hoagland全營養液澆灌，光照16h，光強度 200μmol/（m2·s），相對濕度是 60％-70％，鹽角草長至3cm左右時進行疏苗，每盆保留20株左右，生長2個月后分別用0、10、200、500和800mmol/L NaCl進行脅迫處理，適時補充溶液，200mmol/L NaCl處理的植株在6、24、48、72和120h進行地上部和根部分別取樣，其余4個處理均在72h后取樣，液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2.2 SeHKT1基因部分編碼序列的獲得 TIANGEN RNA試劑盒提取鹽角草0和200mmol/L NaCl處理的地上部及根部總RNA，將兩種RNA混合作為模板反轉為cDNA，根據鹽角草轉錄組Unigene測序結果（由華大基因測轉錄組數據）用軟件Primer 5.0設計引物SeHKT1：正向引物：5'-AATGGAATGGAGTAATGAAGGA-3'；反向引物：5'-TATGTGGGAAATGAATGGGCTA-3'。PCR擴增程序：95℃變性4min；95℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min，36 個循環 ；72℃延伸10min。將PCR擴增產物純化、連接pMD18-T vector（TaKaRa），經大腸桿菌轉化及陽性菌落篩選后，提取陽性質粒送華大基因公司測序，測序結果與轉錄組序列進行比對分析。

1.2.3 5'-RACE及3'-RACE 利用SMARTer RACE cDNA Amplification kit試劑盒（Clontech），以鹽角草0和200mmol/L NaCl處理的地上部及根部混合RNA為模板合成5'-Ready cDNA和3'-Ready cDNA。根據所獲得的SeHKT1基因部分cDNA序列，設計RACE特異性引物。5'端 SeHKT1（5）：5'-ACGACCAAC ATAGCTGGTGCAATGGAGG-3'及 5'端的巢式引物SeHKT1（Nest 5）：5'-CCAACATAGCTGGTGCAAT GGAGGAAAG-3'；3'端 SeHKT1（3）：5'-TGGTATG GATTTGCAGGGAGGTGGAGTG-3'及3'端的巢式引物 SeHKT1（Nest 3）：5'-GGATTTGCAGGGAGGTGG AGTGACCAAG-3'。第一輪反應條件是：95℃ 4min；95℃ 30s，68℃ 45s，72℃ 2min，5 個循環 ；95℃30s，66℃ 45s，72℃ 2min，5 個循環 ；95℃ 30s，64℃ 45s，72℃ 2min，35 個循環 ；72℃ 10min。通過第二輪巢式PCR獲得末端擴增產物，分離純化此PCR產物后連接pMD19-T載體并測序。

1.2.4 鹽角草SeHKT1基因 cDNA全長的獲得 測序結果用DNAMAN和NCBI網站上的Blast比對工具進行分析和拼接得到SeHKT1全長序列1761bp。從全長序列兩端設計引物：SeHKT1-S：5'-AAAATCCTCTTGTACTCCATTAAGC-3'，SeHKT1-A ：5'-GTTTTAGAGGAGTTTCCAAGCTTTG-3'。 按 照 程 序 95℃ 4min ；95℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 2min，35 個循環 ；72℃ 10min進行cDNA全長擴增，分離純化PCR產物后連接pMD19-T載體并測序，進一步確認測序拼接結果。

1.2.5 生物信息學分析 通過MEGA5.1對HKT類蛋白序列進行系統進化樹聚類分析，利用ProtParam tool（http ：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析SeHKT1蛋白分子量和理論等電點，利用TMHMM Serverv 2.0及 TMpred（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）分析該蛋白序列跨膜區和跨膜方向，利用Protscale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列疏水性，利用InterProScan（http ：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）分析蛋白質結構域。

1.2.6 SeHKT1基因的實時熒光定量表達分析 利用RNA植物提取試劑盒（QIANGEN）分別提取200mmol/L NaCl處 理 6、24、48、72、120h及 0、10、500、800mmol/L NaCl處理地上部和根部總RNA，0mmol/L NaCl處理作為對照，以鹽角草Tubulin基因作為內參，引物序列為：SeTubulin-S：5'-AGGTCAACAAAGACAGCA-3'；SeTubulin-A：5'-AGCGAAAATGAGAGAGTG-3'。根據上述獲得的SeHKT1基因全長序列設計定量引物：SeHKT1r-F：5'-CTATCTTGCCATCTTCACCATTATT-3'，SeHKT1r-R ：5'-GTCACTCCACCTCCCTGC-3'。按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（TaKaRa）操作 ：95℃ 30 s；95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環反應，添加熔解曲線程序（從65℃-95℃，每5 s增加0.5℃并讀取熒光值一次）。反應混合液在Bio-Rad熒光定量96孔PCR儀中進行反應，所有的樣品都設置3個重復。反應結束后獲得SeHKT1和內參基因SeTubulin在各個樣品的Ct值（threshold cycle），按照 2-△△Ct方法［11］對實驗數據進行處理，計算基因在各個樣品中的相對表達量。

2 結果

2.1 SeHKT1基因部分序列的獲得

根據前期本實驗室鹽角草轉錄組測序結果獲得的片段設計正反向引物，利用高保真酶擴增獲得800bp左右的PCR產物（圖1-A），克隆并測序后提交NCBI網站進行Blast分析，發現SeHKT1基因與畢氏海篷子SbHKT1基因、鹽地堿蓬SsHKT1基因氨基酸序列相似性較高，分別為95％、76％、62％和52％，故推測該片段為鹽角草HKT1基因的部分序列，故命名為SeHKT1。

2.2 SeHKT1基因cDNA末端RACE產物

5' RACE PCR擴增出3條帶（圖1-B），測序后通過BLAST及DNAMAN軟件分析表明第一條1.2 kb左右的條帶是SeHKT15'端序列，3' RACE巢式PCR擴增出750bp左右的預期產物（圖1-C）。

圖1 SeHKT1基因的PCR擴增

2.3 SeHKT1基因完整開放閱讀框（ORF）的獲得

利用軟件DNAMAN將SeHKT1 cDNA的5'端和3'端測序結果，與已知的SeHKT1基因部分編碼序列拼接，利用NCBI中的Open Reading Frame Finder工具分析得到1653bp完整的ORF（GenBank登錄號為KP739261），編碼550個氨基酸。從ORF兩端設計引物對cDNA擴增并測序，進一步確認SeHKT1的全長序列（圖1-D）。

2.4 SeHKT1基因生物信息學分析

2.4.1 SeHKT1基因蛋白同源性分析 NCBI中Blast分析顯示該蛋白與畢氏海篷子SbHKT1、鹽地堿蓬SsHKT1、冰葉日中花McHKT2、赤桉EcHKT1、EcHKT2氨基酸序列同源性分別為95％、76％、62％和52％。應用MEGA5.1軟件對HKT類蛋白質序列進行系統進化樹聚類分析也表明，SeHKT1與畢氏海篷子SbHKT1、鹽地堿蓬SsHKT1、冰葉日中花McHKT2、赤桉 EcHKT1、EcHKT2、大麥 HvHKT1；5、水稻OsHKT7屬于一組，同源性較高；水稻OsHKT1、OsHKT3、OsHKT9與小麥TaHKT1、蘆葦PhaHKT1一組，OsHKT4、OsHKT6與HsHKT4為一組（圖2）。

圖2 SeHKT1蛋白與其他物種HKT類蛋白系統進化樹分析

圖3 SeHKT1跨膜分析

2.4.2 SeHKT1蛋白特性、結構域及跨模性分析 利用ProtParam tool分析SeHKT1蛋白分子量為62.41kD，理論等電點為9.35，帶正電荷的氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）總數為36個，帶負電荷的氨基酸殘基（精氨酸和賴氨酸）總數為54個，該蛋白的穩定指數為34.89，說明該蛋白較穩定。經TMHMN（圖3-A）及TMpred（圖3-B）共同分析推測SeHKT1具有10個跨膜區（12-34，44-66，117-139，209-231，244-266，281-303，337-359，440-462，477-499），跨膜區長度均為23個氨基酸殘基。InterProScan軟件分析SeHKT1具有一個信號肽序列（1-35）和一個TrkH家族特征序列（199-539），具有跨膜運輸活性和陽離子轉運載體結合位點，因此推測SeHKT1為跨膜運輸蛋白。通過ProtScale工具分析（圖4）顯示，該蛋白在N端、C端及跨膜區均存在明顯的疏水區（11-67，8-143，200-236，241-265，271-306，334-357，390-414，446-467，477-493，521-540），ProtParam tool分析該蛋白氨基酸的平均疏水性為0.376，表明該蛋白具有強烈的疏水性，符合載體蛋白的特點。

圖4 SeHKT1 疏水性分析

2.5 SeHKT1基因在鹽脅迫下表達分析

由圖5-A顯示，SeHKT1基因主要在根部表達，在地上部表達相對較低，無鹽條件下在地上部表達量極低。NaCl處理條件下該基因在地上部和地下部的表達均明顯增加，說明該基因受鹽誘導表達；隨著NaCl處理濃度的增加，SeHKT1在根部表達量在10mmol/L濃度下最高，隨NaCl濃度升高，表達量逐漸降低。而在地上部，SeHKT1在200mmol/L NaCl處理下表達量最高，呈現先上升后下降的趨勢（圖5-A）。地下部直接接觸外界鹽脅迫，因此SeHKT1的響應更為敏感和快速，而在地上部響應則相對遲鈍。在200mmol/L NaCl處理下（圖5-B），SeHKT1主要在地下部表達，處理6h該基因在地下部表達量達到最高峰，24h后開始下降；而地上部SeHKT1表達量緩慢提高，直到48h達到最高值。此外，該基因在地上部的表達量在200mmol/L NaCl處理時最高（圖5-A）。在鉀饑餓的條件下該基因在根部和地上部的表達均明顯升高，在地下部的表達量仍高于地上部，組織的差異表達結果與上文一致（圖5-C）。

3 討論

鹽角草是已知最耐鹽的高等植物之一，不僅能夠忍受1000mmol/L的NaCl［12］，而且需要一定的鹽分來維持其最適生長［13］。鹽角草需要具備一定的細胞及分子水平的調控策略以適應長期生長的鹽漬環境。因此，研究鹽角草的耐鹽機制及挖掘耐鹽基因具有潛在的應用價值。

圖5 SeHKT1 在不同處理下不同組織中的相對表達量分析

目前已經有研究證明在許多植物物種中HKT（High-affinity K+Transporter）基因家族成員在調控細胞免受Na+毒害機制上發揮重要作用［14］。鹽角草具備有效的離子轉運能力并將其區隔化到液泡中［1］，以避免Na+對細胞器的損害。SeHKT基因家族能夠調控Na+和K+轉運及細胞內K+/ Na+穩態，可推測該基因家族對鹽角草的耐鹽性具有重要貢獻。

本研究利用鹽角草轉錄組Unigene序列及RACE擴增技術成功獲得了一條HKT全長基因，通過系統進化樹聚類分析暫命名為SeHKT1。利用生物信息學手段預測，SeHKT1蛋白具有10個跨膜域，一個信號肽序列（1-35）和一個TrkH家族特征序列（199-539），具有跨膜運輸活性和陽離子轉運載體結合位點，在N端、C端及跨膜區均存在明顯的疏水區，符合跨膜運輸載體的特點。通過生物信息學分析，可預測基因的功能，編碼蛋白的特性，為后續基因功能的驗證實驗指明了方向。

本研究通過熒光定量PCR技術，對鹽角草SeHKT1基因在不同組織，不同處理時間，不同濃度NaCl及K+缺失條件下的表達特性進行了分析。結果顯示，SeHKT1主要在根中表達，高鹽和鉀饑餓誘導條件下，表達量均升高，尤其是在根部能對NaCl脅迫和K+缺失快速響應，通過提高基因表達量來增強K+/Na+運輸載體功能。200mmol/L NaCl濃度是鹽角草生長的最適濃度［15］，該條件下根部組織被處理6h時SeHKT1基因被快速誘導表達，但在24h后表達量開始逐漸下降，在48h后該基因相對表達量低于對照，表明SeHKT1基因能夠短時間內響應外界環境Na+離子的變化而上調表達，吸收一定量的Na+離子進入鹽角草細胞內，以維持一定的滲透壓平衡。大量的研究也表明，在長期進化過程中鹽生植物演化出一套完整的適應高鹽環境機制［16］，其內外的滲透壓主要靠大量Na+來調節［17］，因此一定濃度的NaCl會促進鹽生植物的生長，在高鹽環境下，其細胞中K+含量及胞質中K+/Na+比幾乎不受影響［10］，推測鹽生植物細胞內離子平衡調節與HKT類蛋白密切相關。低鹽條件下（10mmo/L）SeHKT1 在根部的相對表達量較高，這可能與吸收更多Na+維持體內滲透勢有關；在高鹽條件下（500和800mmol/L），該基因表達量有所下降，可能與Na+限制K+吸收機制相關，因此，HKT類蛋白對于鹽角草細胞內離子平衡調節具有重要作用［18］。

綜上所述，鹽角草SeHKT1基因全長的獲得及系統的表達分析有助于我們進一步研究該基因在鹽生植物中調節離子平衡，維持細胞滲透壓，揭示真鹽生植物的耐鹽機制，利用基因工程手段將其運用于培育新的耐鹽品種具有一定的意義［19］。

4 結論

真鹽生植物鹽角草SeHKT1基因氨基酸序列中具有一個信號肽序列（1-35 aa），一個TrKH家族特征序列；該基因編碼的蛋白具有跨膜載體蛋白活性，共10個跨膜域，N端、C端及中部多個跨膜區呈現明顯的疏水性，符合載體類蛋白特點，因此推測SeHKT1蛋白為跨膜運輸蛋白。qRT-PCR分析表明SeHKT1基因主要在根部表達，其表達能夠響應外界NaCl和鉀離子濃度變化，編碼蛋白可能參與Na+和K+的吸收和運輸。

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