大腸桿菌DPS表達、體外自組裝及抗氧化作用研究

劉文 賈義華 方麗 劉長愛 陳浩 路凱敏 胡巍

氧和鐵是生物必需的營養元素，參與代謝時會產生O2-、H2O2、·OH等自由基（Reactive oxygen species，ROS），造成氧化壓力［1］，對 DNA、蛋白質、膜脂等細胞組分造成氧化損傷［2，3］。Almiron和Azam等［4，5］在長期饑餓培養的大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）中發現一種消除ROS的抗氧化蛋白，命名為DPS（DNA-binding proteins from starved cells）。現已證實DPS蛋白廣泛分布于細菌體內，是一種重要的抗脅迫蛋白［6］。細菌處于生長靜止期或受脅迫時在體內表達DPS蛋白，并與DNA結合，形成緊密的DPS-DNA復合體，保護DNA免受氧化損傷［7］。同時，作為鐵蛋白超家族一員，DPS以十二聚體結構結合并儲存鐵，調節鐵的供應，防止鐵鹽沉淀造成的毒性損傷［8，9］。十二聚體結構作為DPS發揮功能的重要結構基礎，其自組裝過程研究未見報道。本研究以大腸桿菌基因組為模板，用基因工程原核表達DPS，應用純化的DPS觀察其在體外條件下的自組裝情況，旨在為研究其自組裝和抗氧化活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、載體、培養基和試劑 菌株為大腸桿菌0111菌株和DH5α菌株（本實驗室保存）。原核表達載體是pBV220質粒。LB細菌培養基由Oxiod公司胰蛋白胨和酵母提取物配制而成。鼠源抗HIS單抗（Anti-His mA）為Earthox產品，羊抗鼠辣根過氧化物酶標二抗購自北京中杉金橋生物技術公司。親和層析用1mL His Trap FF crude column柱為GE公司產品。其他試劑為國產分析純。

1.1.2 工具酶和試劑盒 核酸限制內切酶EcoR I、BamH I，Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等均為Fermentas公司產品。多功能DNA純化回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒、細菌基因組提取試劑盒均購自北京博大泰克公司。透析袋（Ф27 mm）為Union Carbide Corporation產品。DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計、基因擴增和表達載體構建 模板為提取的0111菌株基因組DNA。特異性上下游引物為5'-CGGAATTCATGAGTACCGC-3'和5'-GCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGTTCGATGTTAGACTCG-3'，是參考GenBank中大腸桿菌dps基因序列設計，其中上游引物引入EcoR I酶切位點序列和ATG，下游引物引入6×His序列（斜體部分）、TAA以及BamH I酶切位點序列。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

目的基因和提取的pBV220質粒分別用EcoR I、BamH I雙酶切，T4連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞，陽性克隆進行雙酶切和測序鑒定。基因測序送北京華大基因公司完成測序。

1.2.2 蛋白表達和純化 工程菌在LB培養基中37℃培養至對數期，42℃過夜誘導表達目的蛋白。沉淀細胞超聲破碎后分別取上清和沉淀，用SDS-PAGE（4％濃縮膠，12％分離膠）和Westernblotting檢測鑒定目的蛋白。

用His Trap FF crude column親和層析柱純化目的蛋白。超聲破碎菌體并提取包涵體，用含6mol/L脲的20mmol/L磷酸鹽緩沖液（PB）溶解包涵體后加入到層析柱中，再用含100-400mmol/L咪唑的特異性洗脫緩沖液洗脫，SDS-PAGE分析洗脫組分。

1.2.3 DPS自組裝鑒定 將純化的DPS蛋白分別用含4、2和0.5mmol/L脲的PB緩沖液，分級逐步透析去除蛋白溶液中的6mmol/L脲，進行非變性PAGE電泳分析，濃縮膠為4％，分離膠為10％。

1.2.4 DPS對DNA的抗氧化保護 將等體積DPS（1.8mg/mL）和等體積pBV220質粒（40 ng/mL）混合后，加入等量的Fenton試劑（終濃度為10mmol/L H2O2，100mmol/L FeSO4，50mmol/L Tris-HCl），37℃孵育24h，1.2％瓊脂糖電泳，檢測質粒DNA降解情況。同時分別用質粒、加熱變性的DPS、BSA蛋白與Fenton試劑孵育作為對照體系。

2 結果

2.1 目的基因擴增與表達載體構建

圖1 pBVDPSHis載體及鑒定

經PCR擴增獲得了一條特異性DNA片段，長度與dps基因522bp相當，重組載體雙酶切鑒定也得到了該片段（圖1）。經DNA測序鑒定，重組載體插入了3'-末端帶有6×His標簽的dps基因序列（測序結果略）。

2.2 DPS蛋白表達及純化鑒定

從SDS-PAGE結果（圖2-A）可以看出，42℃誘導的宿主細胞中存在分子量接近20kD的表達蛋白條帶，該蛋白與DPS單體蛋白的理論分子量19.5kD相當。用Anti-His mA單抗進行Western blotting檢測，結果（圖2-B）表明，工程菌成功表達了帶有HIS標簽的DPS蛋白。另外，表達蛋白主要存在沉淀中，說明該蛋白是以包涵體形式獲得高效表達。

圖2 表達產物的SDS-PAGE（A）和Western blotting分析（B）

蛋白純化后的SDS-PAGE結果（圖3）顯示，在特異性洗脫組分中含有目的蛋白（圖3泳道6-9），其中300和400mmol/L咪唑洗脫組分中得到較純的DPS蛋白。

圖3 DPS蛋白SDS-PAGE結果

2.3 DPS體外自組裝

純化的DPS蛋白進行PAGE分析結果（圖4）顯示，DPS蛋白在6mmol/L脲的PB中出現多條條帶，說明變性蛋白雖能組裝成大分子量（十二）聚體，但仍然有大量的低聚體存在，分子量大多都超過66.7kD。相比而言，脲降低到0.5mmol/L時蛋白低聚體比例大大降低，大分子量（十二）聚體蛋白更加穩定。如果在0.5mmol/L脲的蛋白中添加NaCl，可以明顯促進大分子聚合體的形成，特別是50mmol/L NaCl濃度時，幾乎所有蛋白都自組裝成穩定的十二聚體蛋白，說明NaCl能促進自組裝過程。

圖4 純化的DPS蛋白PAGE結果

2.4 DPS對DNA的抗氧化保護

結果（圖5）顯示，Fenton反應后，質粒DNA在不含DPS的反應體系中被完全降解，在含DPS的反應體系中保持不變，在含熱變性DPS的體系中被部分降解，而在含BSA蛋白的對照組同樣被降解。上述結果說明，Fenton反應產生的羥基自由基對DNA分子造成氧化破壞，而DPS對DNA分子有抗氧化保護作用，加熱變性后的DPS仍有部分保護作用，而且DPS對DNA的抗氧化保護是其特異性的功能，BSA不具備同樣功能。

3 討論

作為細菌內的抗氧化保護蛋白，DPS蛋白在菌體內翻譯、自組裝成十二聚體結構發揮作用。兩個相鄰DPS蛋白單體，側面反向交叉形成一個面，六個面圍城一個近乎球形的六面體，該球形六面體外徑9nm，內徑4.5nm，其中空腔穴帶有負電荷，是鐵成核及礦化部位［10］。有文獻報道，DPS聚合體是由6個二聚體組合而成，也有說是4個三聚體組合而成［11，12］。本實驗中觀察到有不同分子量大小的聚合體，部分支持了這種觀點，但也說明還可能存在其它聚體形式。實驗中獲得的純化蛋白經除脲復性和添加NaCl后，可以形成穩定的分子量均一的聚合，這與文獻報道的DPS十二聚體的活性結構相吻合［13］。因此可以確定基因工程表達的DPS能夠自組裝成十二聚體結構。而DPS在Fenton反應中對質粒DNA的保護作用的實驗結果，證明體外表達純化的DPS能夠發揮抗氧化保護蛋白功能。

圖5 質粒保護瓊脂糖凝膠電泳結果

DPS一方面通過將Fe2+轉化成羥基氧化鐵（FeOOH）形式防止羥自由基產生［14］，并儲存鐵元素，調節鐵的利用和儲存間平衡；另一方面，DPS能夠在逆境環境下與DNA分子形成非序列依賴性的DPS-DNA復合體結晶，穩定DNA分子［15-17］。有些病原菌甚至利用DPS蛋白的活性抵抗藥物作用［18］。因此DPS結構及其抗氧化作用都是抗病原菌藥物設計的潛在靶點。另外，DPS顆粒狀結構還是小分子抗原的展示平臺，可用于納米疫苗的研究。

4 結論

基因工程原核表達的帶有His標簽的DPS蛋白，純化后能自組裝成穩定的十二聚體結構并具有抗氧化保護質粒DNA作用。

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