曲霉固液態發酵產殼聚糖降解酶組分及酶學特性分析

閻賀靜 時月 劉暢

殼寡糖溶解度大，易于被人體吸收利用，且具有抗腫瘤、抗菌免疫激活及保濕吸濕等許多生理活性，在醫藥、保健品方面的應用令人矚目［1-3］。目前，殼寡糖的制備來自于殼聚糖的降解，主要有化學降解法、物理降解法和酶降解法［4，5］。其中酶降解法由于反應條件溫和易控，寡糖得率高、功能性更強及不易造成環境污染等優點，是殼寡糖制備的主要方法［6，7］。殼聚糖酶（Chitosanase，EC 3.2.1.99）對殼聚糖具有專一性，獲得的寡糖分子量范圍較窄，功能性更強，是最理想的殼寡糖制備酶［7］。但目前由于殼聚糖酶產量低，商品價格昂貴，無法用于大規模生產。研究發現許多水解酶如蛋白酶、果膠酶、溶菌酶及脂肪酶等多種常見工業酶制劑對殼聚糖有降解作用［8-11］。國內外的學者對于不同來源的多種非專一性酶對殼聚糖的降解特性及產物特征等進行了研究發現，效果較為顯著的酶主要有來自Trichoderma viride 及Aspergillus niger的纖維素酶、來自Aspergillus oryzae的半纖維素酶、來自Aspergillus niger的果膠酶，以及來自Aspergillus niger 的真菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶和溶菌酶等［12，13］。還有學者將幾種非專一性降解酶如纖維素酶、蛋白酶和α-淀粉酶共同作用于殼聚糖發現，這些酶水解殼聚糖具有協同作用［14］。多項研究表明，將這些酶復配后用于殼聚糖的降解，其水解作用比單一酶強，用于殼寡糖的制備效果更佳，可以得到相對分子質量低于3 000的低聚糖［9-11］。因此，開發和制備殼聚糖降解復合酶制劑對于殼寡糖的制備很有必要。

目前，關于復合酶對殼聚糖的酶解的研究多集中于酶的種類、復配和降解效果及相關工藝等方面［9，14-16］，而關于殼聚糖降解用復合酶制劑生產方面的報道較少。固態發酵具有酶系全、活性高及生產成本低等優勢，隨著固態發酵技術的發展，固態發酵已廣泛應用于食品、飼料及洗滌劑等工業用酶的生產［17-20］。因此，在確保菌種優良和合適的培養條件下，應用固態發酵技術生產含有多種酶（如纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶及淀粉酶）活性的殼聚糖非專一性降解酶制劑復合物是可行的，這很有可能為殼聚糖降解復合酶的開發提供一種新途徑。

本研究以一株產殼聚糖降解酶的生產菌——曲霉為出發菌株，對其進行固和液態發酵，對兩種發酵粗酶產物的組分及酶學特性進行對比和分析，并對其相關因素進行進一步分析，確定固態發酵在生產殼聚糖降解酶復合酶制劑方面的優勢，旨為高效殼聚糖降解復合酶制劑的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：曲霉（殼聚糖酶生產菌）由武漢生物工程學院酶工程實驗室提供（此菌為實驗室新篩選保藏菌種，尚未取得菌種保藏編號）。

斜面種子培養基（g/L）：膠體殼聚糖1.0，（NH4）2SO40.5，酵母膏 0.5，K2HPO40.07，KH2PO40.03，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，葡萄糖 0.1，自然pH。液體發酵培養基（g/L）：膠體殼聚糖1.0，（NH4）2SO40.5，酵母膏 0.5，K2HPO40.07，KH2PO40.03，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，葡萄糖 0.1，自然pH。固態發酵培養基（g/L）：營養液：MgSO40.5、K2HPO40.5、KCl 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、ZnSO40.1，殼聚糖4.0，自然pH。麩皮：豆餅粉=3 5，料水比 8 9。

1.2 方法

1.2.1 曲霉液態發酵及粗酶液的制備 取培養成熟（培養2d）的斜面孢子制備菌懸液，接種量（體積分數）為0.2，裝液量75mL/250mL，180r/min，32℃恒溫培養9d，每天取樣，將發酵液用布氏漏斗（6-7層濾紙）進行抽濾和微濾得粗酶液，以殼聚糖為底物測殼聚糖降解酶酶活。

1.2.2 曲霉固態發酵粗酶液的制備 取培養成熟（培養2 d）的斜面孢子制備菌懸液，接種量1mL，30℃恒溫培養15d，每天取樣，及時將固體曲研碎，按固體曲重量的10倍加入浸提液（pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液），浸提1h，離心得粗酶液，以殼聚糖為底物測殼聚糖降解酶酶活。固態發酵產酶量以1 g固體曲重所含酶活計算。

1.2.3 酶活測定 殼聚糖降解酶酶活的測定：以1％膠體殼聚糖為底物，采用DNS法［14］測定。酶活單位定義為：在測定條件下（pH5.6，50℃準確反應15min），每分鐘水解底物生成1μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位，單位為U/mL。果膠酶酶活測定，以多聚半乳糖醛酸為底物，采用DNS試劑測定［21］。酶活力單位定義：在測定條件下（pH5.6，50℃準確反應30min），每分鐘水解底物生成1μmol半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個酶活力單位，單位為U/mL。纖維素酶酶活測定，以羧甲基纖維素鈉為底物，按Bailey和Nevalainen［22］的方法測定。酶活力單位定義：在測定條件下（pH5.6，50℃準確反應30min），每分鐘催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位，單位為U/mL。蛋白酶酶活測定，以酪蛋白為底物，采用福林-酚法。酶活力單位定義：測定條件下（pH5.6，50℃準確反應10min），每分鐘催化底物生成1μmol酪氨酸所需的酶量定義為一個單位，單位為U/mL。淀粉酶酶活測定，以可溶性淀粉為底物，采用DNS法測定。酶活力單位定義：在測定條件下（pH5.6，50℃準確反應15min），每分鐘催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個單位，單位為U/mL。脂肪酶酶活測定，以甘油三酯為底物，參照國家標準進行滴定。酶活力單位定義：在測定條件下，每分鐘催化底物生成1μmol的可滴定的脂肪酸即為一個酶活力單位，單位為U/mL。

1.2.4 固液態發酵產殼聚糖降解酶的最適反應溫度及溫度穩定性 以1％膠體殼聚糖為底物，在不同溫度（30、35、40、45、50、55和60℃）條件下測兩種粗酶液的殼聚糖降解酶酶活，以活力最高者為100％，確定兩種酶制劑的最適反應溫度；將酶液在不同溫度（30、35、40、45、50、55℃和 60℃）條件下分別保溫一定時間（30、60、90、120和150min）后，在最適條件下測定兩種酶制劑的殼聚糖降解酶酶活，以未進行保溫的酶液的酶活為100％計算相對酶活力，確定測試酶的溫度穩定性。

1.2.5 固液態發酵產殼聚糖降解酶的最適反應pH及酸堿穩定性 以1％膠體殼聚糖為底物，在不同pH（4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0和 7.6）條件下測兩種酶制劑的殼聚糖降解酶酶活，以活力最高者為100％，確定兩種酶制劑的最適反應pH；將酶液在不同 pH（4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0和7.6）件下分別保存一定時間（30、60、90、120和150min）后，在最適條件下測定兩種酶制劑的殼聚糖降解酶酶活，以在不同pH條件下保存前的酶活為100％，確定兩種酶制劑的酸堿穩定性。

2 結果

2.1 曲霉固液態發酵產酶過程分析

本實驗對曲霉進行固液態發酵，結果（圖1）表明，兩種發酵過程的發酵趨勢基本一致，隨發酵的進行，酶液的殼聚糖降解活力先增加后減少。但同時發現兩者的發酵速度有很大不同，其中液態發酵較固態發酵提前4 d到達產酶高峰期。發酵結束后，測定固液態發酵粗酶酶活，分別為10.33U/g（固體曲）和4.85U/mL（發酵液）。

對圖1進行綜合分析認為，固態發酵的營養物質結構致密，成分復雜不易吸收，微生物生長周期長，利于酶的積累，由此體現出固態發酵的優勢。液態發酵后期酶活會迅速降低，說明該殼聚糖降解酶在此狀態下穩定性較差。因此，應正確把握液態發酵結束時間，否則酶活損失較大。

圖1 曲霉固液態發酵產殼聚糖降解酶過程曲線

2.2 曲霉固液態發酵產酶組分比較

對獲得的粗酶液進行稀釋或濃縮，使兩種粗酶液以殼聚糖為底物的酶活相等，測定固液態發酵酶產物的各種酶酶活，結果見表1。

表1 曲霉固液態發酵產酶組分

由表1可見，該曲霉固液態發酵產酶酶活均以殼聚糖降解活性為主。但固態發酵粗酶同時具有多種常見糖苷酶，如纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、脂肪酶和半纖維素酶酶活。對曲霉液態發酵產酶進行分析發現，該酶具有較高殼聚糖降解活性，同時具有相對較高的纖維素酶酶活和較低的蛋白酶酶活，不含有脂肪酶和淀粉酶酶活。因此推測有兩種可能：（1）該曲霉在液態發酵中所產酶可能為具有纖維素酶活的專一性殼聚糖酶（EC 3.2.199）；（2）也可能該曲霉同時分泌了專一性殼聚糖酶（EC 3.2.199）和纖維素酶。

以上分析表明，本研究所用曲霉在液態發酵條件下分泌酶組分較單一，在固態發酵時可以分泌多種具有殼聚糖降解活性的酶。

2.3 煙曲霉固液態發酵產殼聚糖降解酶酶學性質

2.3.1 固液態發酵產殼聚糖降解酶的最適反應溫度 分別在不同溫度下測定不同來源的殼聚糖降解酶的活力，以活力最高者為100％對照，確定酶的最適反應溫度，結果如圖2所示。固液態發酵產殼聚糖降解酶最適反應溫度分別為45℃和40℃。并且，固態發酵殼聚糖降解酶具有較寬泛的溫度適宜范圍，在40-55℃之間均具有較高的酶活，液態發酵殼聚糖降解酶在35-40℃之間的活性較高。這可能跟固態發酵酶組分比較復雜有關，不同的酶在自身適宜的溫度條件下分別表現出較高酶活。

圖2 溫度對固液態發酵殼聚糖降解酶酶活性的影響

2.3.2 固液態發酵產殼聚糖降解酶的溫度穩定性 考察測試樣品的溫度穩性，結果如圖3所示。固態發酵殼聚糖降解酶熱穩定性高于液體發酵殼聚糖降解酶。液體發酵殼聚糖酶在30℃時穩定性最高，保溫150min后仍維持原酶活的64.5％。隨著溫度的增加，酶的穩定性迅速下降，50℃時保溫150min，殘余酶活僅為13.4％。固態發酵殼聚糖降解酶在40-50℃范圍之內均具有較高的穩定性，50℃保溫150min后維持原酶活的58.3％左右，這可能和其復雜的酶組分有關。

2.3.3 固液態發酵產殼聚糖降解酶的最適反應pH和酸堿穩定性 對固液態發酵殼聚糖降解酶最適反應pH進行考察，結果如圖4和圖5所示。

圖3 固液態發酵產殼聚糖降解酶溫度穩定性

圖4 pH對固液態發酵產殼聚糖降解酶酶活性的影響

由圖4所示，固液態發酵殼聚糖降解酶最適反應pH分別為5.8和5.2，由此可見兩者的最適反應pH差異不大。但固態發酵產酶在pH4.6-6.4范圍內活性較高，而液態發酵產酶在pH4.6-5.8范圍內活性較高，其pH適宜范圍略窄于固態發酵來源的殼聚糖降解酶。殼聚糖溶于弱酸，堿性不溶，由此可見兩種來源的殼聚糖降解酶最適反應pH與殼聚糖的降解環境pH較為一致。

圖5 固液態發酵產殼聚糖降解酶的酸堿穩定性

考察酶的酸堿穩定性，可以為酶催化反應體系與反應時間的設定提供依據，提高降解效果。由圖5可知，固液態發酵產殼聚糖降解酶在相同的酸堿度范圍內具有相似的穩定性，在pH4.6-6.4范圍內均較穩定，分別在pH4.6和pH5.2時穩定性最高，環境pH＞6.4或pH≤4.0時酶活迅速降低。固態發酵殼聚糖降解酶的酸堿穩定性略高于液態發酵殼聚糖降解酶。例如，在pH4.6環境中保存60、90、120和150min后，固液態殼聚糖降解酶分別保留原酶活的91.11％和80.1％、85.5％和60.24％、73.1％和42.9％、60.1％和29.3％。

3 討論

目前，深層液體發酵已成為主要的工業酶制劑生產方法。但隨著對固態發酵研究的深入，人們發現固態發酵具有液體發酵無法比擬的優勢。例如，原材料廉價、目的產物濃度高、廢水廢渣少等。固態發酵培養基成分復雜，微生物需要代謝各種酶類來為細胞的生長和代謝提供能源［17，18］，這為復合酶制劑的開發提供了便捷而廉價的方法。

本研究以殼聚糖酶生產菌——曲霉為出發菌進行研究，期望通過比較固液態發酵產物的組分及酶學特性發現對殼聚糖降解復合酶生產有價值的信息。結果表明，在固態發酵情況下，該曲霉產酶組分更加復雜，殼聚糖降解酶穩定性更強，溫度和pH適用范圍更廣，這一點符合固態發酵產物的特性，固態發酵酶的酶學特性更加符合工業應用的要求。因此，專一性殼聚糖酶（EC 3.2.199）生產菌的篩選需要更加科學的方法，傳統的以殼聚糖為唯一碳源的普通平板篩選法可能僅適合于殼聚糖降解酶生產菌的篩選。固態發酵殼聚糖降解酶熱穩定性高于液態的，這一特點在殼寡糖工業制備中的應用較液態的發酵殼聚糖降解酶更具優勢和潛力。更加值得注意的是，固態發酵產物中含有纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶及果膠酶等是殼聚糖降解的主要的非專一性酶［8-11］，這為殼聚糖降解酶的生產開發提供了新的思路。目前有關殼聚糖酶的生產研究大多都集中在菌種基因工程菌的構建、發酵條件的優化和控制方面［23-25］；對殼聚糖降解的應用研究主要集中在將各種單一酶進行復配，考察其降解效果和條件方面［8-11］，而忽略了固態發酵本身可以提供廉價復合酶這一特點。當然，若要利用固態發酵制備有效的殼聚糖降解酶，需要做的工作還很多。例如，首先需要有高效的生產菌種；其次還需要對其培養條件、底物種類及產物特性進行廣泛的研究等，還需要更深入的研究揭示微生物固態發酵產酶種類及其含量的影響因素及相關的機理等。因此，還需要進行大量的研究探索。

利用固態發酵可獲得多組分殼聚糖降解酶，是獲得復合酶組分的有效方法。培養基組分對微生物產酶包括酶組分、含量和特性等具有很大影響，若系統考察固態發酵培養基對煙曲霉產酶的影響，或許能獲得具有特定配比及適合應用要求的復合酶制劑。但若通過此法開發滿足殼寡糖工業生產所需的復合酶制劑還需要進行系統和深入的研究。由于研究手段的限制，本研究未能進一步確認各酶酶活所對應的具體酶的種類、蛋白結構等信息；同時也未能探討不同的固態發酵培養基底物對所得復合酶組分和酶學性質的影響。只是對固液態發酵酶組分及其基本酶學性質進行了簡單的研究，得出了固態發酵產殼聚糖降解酶可應用于殼聚糖降解的有利信息，但還未考察固態發酵產殼聚糖降解酶在殼聚糖降解方面的應用情況，此方面的研究有待進一步進行，以確認固態發酵產復合酶對殼聚糖降解的具體作用。

4 結論

固液態發酵具有相同的發酵趨勢，但發酵周期不同。固態發酵產殼聚糖降解酶產酶高峰期出現在發酵第9天，比液態發酵產酶高峰期延遲4 d。

固態發酵所得酶組分復雜，除具有殼聚糖降解活性外，還具有蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、脂肪酶和半纖維素酶活；液態發酵所得酶組分較單一，除殼聚糖降解活性外，還表現出較小的蛋白酶酶活和纖維素酶酶活。

固液態發酵所產酶最適反應溫度分別為45℃和35℃，適宜溫度分別40-55℃和35-40℃。固態發酵產酶較液態產酶具有更加寬泛的適宜范圍，兩者分別在40-50℃和30℃時穩定性最高，50℃時保溫150min，殘余酶活分別為62.5％和13.4％。

固液態發酵產酶的最適反應pH分別為5.8和5.2，分別在pH4.6-6.4和pH4.6-5.8具有較高活性；兩者在pH4.6-6.4范圍內均較穩定，分別在pH4.6和pH5.2時穩定性最高。在pH4.6和pH5.2環境中保存150min，固液態殼聚糖降解酶分別保留原酶活的60.1％和29.37％以及45.1％和39.1％。

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