有機磷農藥降解菌YC-YH1中mpd和ophc2的克隆及酶學性質分析

賈陽 史延華 任磊 喬鋮 王俊歡 閆艷春

隨著世界人口的增加，對糧食需求的不斷增長。為增加農作物的產量，避免病蟲害造成的損失，各種農藥的使用量也在逐漸增長。有機磷農藥（Organophosphorus pesticides，OPS）是一類非常重要的農藥品種，全球已注冊的500多種農藥或農藥代謝物中，有機磷農藥占有很大的比例［1］。目前，世界上有機磷農藥種類達150多種，我國生產的有機磷農藥品種有20余種，年產量超過10萬t，占我國農藥總產量的80％以上［2］。雖然有機磷農藥的大量使用提高了作物的產量，但由于有機磷農藥的半衰期較長，大量的農藥會殘留在水體和土壤環境中造成嚴重污染［3-5］。水體、土壤及農產品中殘留的有機磷農藥已對人們的健康安全帶來極大威脅［6-8］。乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）是一種神經遞質，在神經信號傳導過程中發揮著重要作用。有機磷農藥能夠抑制乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）的活性從而使ACh不能降解而大量聚積進而對人體產生毒性［9-11］。有研究表明，長期暴露于低劑量有機磷環境下會造成機體多部位損傷，癌癥、老年癡呆、帕金森氏綜合癥和糖尿病等疾病都與包括有機磷農藥在內的環境污染物有關［12］。因此，消除環境中殘留的有機磷農藥一直是人們關注的焦點。

有機磷農藥的降解方式主要可分為化學降解、物理降解和生物降解等［7，13，14］。生物降解是指通過生物的作用將農藥分解成小分子無毒的或者低毒的化合物，并且最終降解為水、CO2和礦物質的過程。相對于物理、化學降解技術，生物降解特別是微生物降解具有高效、操作簡單、成本低、徹底、無二次污染等諸多優點，目前對環境污染物的生物降解已經成為研究的熱點［15，16］。

微生物對有機磷農藥的降解多是依靠酶促反應進行，而利用純化酶對農藥尤其是低濃度農藥的降解效果遠優于利用微生物本身，因為在農藥濃度較低的情況下，降解菌會優先利用其他碳源而不能有效利用農藥作為碳源，而降解酶的專一性高而且不存在碳源的選擇問題，因此降解效果不受碳源影響，于是有機磷降解酶受到越來越多的關注［17］。到目前為止，國內外的學者們已經分離了多種能夠降解有機磷的微生物，并且提取純化了多種有機磷降解酶。1973年，Sethunathan等［18］從水稻田土壤中分離到了第一株能夠降解二嗪農和對硫磷的黃桿菌 Flavobacterium sp. ATCC 27551。1982年，Serdar等［19］發現了能夠降解對硫磷的菌株Pseudomonas diminuta MG。2001年，崔中利等［20］分離到了水解甲基對硫磷的菌株Plesiomonas sp. Stain M6，并克隆到了mpd基因。2002年，陳亞麗等［21］從農藥污染土樣中分離出的一株能徹底降解甲基對硫磷的菌株 Pseudomonas sp. WBC-3。2003年，楚曉娜等［22］從有機磷農藥降解菌Pseudomonas sp. WBC-3 中純化了甲基對硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase，MPH）并對酶性質進行了分析。2003年，伍寧豐等［23］從農藥廠被污染的土壤中分離到了一株產有機磷水解 酶（Organophosphorus hydrolase，OPH）的 菌 株Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1并對其產生的有機磷降解酶OPHC2進行了分離和純化。

目前已報道的有機磷降解菌中只含有一種有機磷降解酶基因，而本研究從一株有機磷農藥降解菌施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri YC-YH1中同時克隆到兩種有機磷降解酶基因mpd和ophc2。將兩種基因分別連接到表達載體并轉化大腸桿菌進行表達，研究了這兩種降解酶各自的酶學特性及二者聯合的酶學特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 甲基對硫磷（Methyl parathion，純度＞99％）購自上海市農藥研究所。對硝基苯酚（p-Nitrophenol）（分析純）購自天津市凱通化學試劑有限公司。4×SDS凝膠上樣緩沖液低分子量標準蛋白、限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、IPTG、DNA片段純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。氨芐青霉素購自Amresco公司。細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。LB培養基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，去離子水1L，121℃滅菌20min。上樣緩 沖 液：Na2HPO4·12H2O 1.78g，NaH2PO4·2H2O 1.38g，NaCl 29.22g，Imidazole 2.0g，去離子水至1L，pH7.4。洗脫緩沖液 ：Na2HPO4·12H2O 1.78g，NaH2PO4·2H2O 1.38g，NaCl 29.22g，Imidazole 34.0g，去離子水至1L，pH7.4。

1.1.2 菌株及質粒 本研究所用菌株為本實驗室分離的有機磷降解菌施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）YC-YH1，在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC No. 9624。E.coli BL21（DE3）購自天根生化科技有限公司。質粒pET-32a購自Novagen公司。

1.1.3 儀器 AKTA avant 蛋白純化系統配Ni柱（HisTrapTMFF crude 1mL），Tecan infinite 200 酶標儀，Bio-Rad（PowerPacTMHV Power Supply）蛋白質電泳儀，BRANSON超聲波儀器（DIGITAL SONIFIER 250）。

1.2 方法

1.2.1 mpd和ophc2基因的克隆 根據施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri YC-YH1全基因組測序結果，用Primer Premier 5.0設計引物（表1），引物P1和P2 PCR擴增mpd基因，引物P3和P4 PCR擴增ophc2基因。以YC-YH1菌株基因組DNA為模板，擴增目的基因。PCR 擴增程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 20s，進行30個循環；72℃延伸10min；10℃保存。擴增產物用DNA片段純化試劑盒純化。

表1 引物名稱及序列

1.2.2 重組質粒的構建 將純化后的mpd和ophc2用BamHⅠ和SacⅠ酶切，同時酶切載體pET-32a，用DNA片段純化試劑盒回收，用T4 DNA連接酶將酶切后mpd和ophc2分別與pET-32a質粒于16℃過夜連接，將連接產物轉化E.coli BL21（DE3）感受態細胞，在含有100mg/L氨芐青霉素的抗性平板上篩選陽性克隆，提取質粒進行驗證。

1.2.3 mpd和ophc2基因的表達及蛋白純化 將已驗證正確的E.coli BL21（pET-mpd）和E.coli BL21（pET-ophc2）分別取300μL接種到30mL液體LB培養基中，37℃下振蕩培養12h。將培養后的菌液取4mL接種到400mL液體LB培養基中，37℃，200r/min振蕩培養至菌液OD600達到0.8，加入IPTG至終濃度1mmo/L，在30℃，200r/min下振蕩培養，誘導3h。然后5000r/min離心8min收集菌體，用30mL上樣緩沖液懸浮菌體后進行超聲破碎。超聲功率為20％，超聲頻率：超聲3s，暫停5s，共超聲破碎20min。破碎完成后12000r/min離心10min，收集上清液進行純化。

用AKTA avant蛋白純化系統對蛋白進行純化，流速1mL/min，上樣26mL，用洗脫緩沖液進行洗脫，從第4mL開始收集，收集2mL蛋白洗脫液。

1.2.4 純化蛋白的檢測 使用SDS-PAGE對純化的蛋白進行純度測定。配制濃度為12％的分離膠，濃度為5％的濃縮膠，固定染色液為考馬斯亮藍R-250（含異丙醇25％，乙酸10％），脫色液含乙酸10％和乙醇5％。未誘導及誘導后的全細胞蛋白處理方法：lmL菌體細胞沉淀加入20μL4×SDS凝膠上樣緩沖液及60μL H2O，100℃加熱10min以充分裂解細胞，12000r/min離心10min使細胞碎片及DNA等沉淀，取適量溶液上樣。純化的MPH和OPHC2分別取60μL加入20μL 4×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，取適量溶液上樣。

1.2.5 酶的活性測定 取1μL甲醇配制的濃度為1×104mg/L的甲基對硫磷母液，1μL酶液，加入到98μL Tris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中 混 勻，28℃反應2min，然后用酶標儀檢測溶液在405nm下的吸光度值。

有機磷降解酶的一個活性單位（U）定義為：在28℃條件下，每分鐘降解1μmol甲基對硫磷所需酶量。在甲基對硫磷的降解過程中，甲基對硫磷的消耗量與其降解產物對硝基苯酚的生成量之間為1 1的關系，所以本研究通過檢測產生的對硝基苯酚的量而得到甲基對硫磷被降解的量。

②建設農田過濾帶。選擇設施農業大棚區北側的1號渠，沿渠道北側布置600 m的農田過濾帶，采用截流溝、植被過濾帶等6種不同的配置模式（見表1），降低農田徑流污染物濃度，減少入河污染物。

1.2.6 酶學性質的測定 分別以純化的MPH、OPHC2以及二者按1 1比例混合的混合酶為材料，在不同溫度、pH及不同金屬離子下檢測酶對甲基對硫磷的降解效率，測定了其最適反應溫度、最適pH及金屬離子對酶活性的影響。

取4μL甲醇配制的濃度為1×104mg/L的甲基對硫磷母液，1μL 酶液，加入到 995μL Tris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中混勻，在不同溫度（20、30、40、50、60、70和80℃）下保溫30min，檢測溶液在405nm下的吸光度值；在不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11和12）下進行酶促反應，測定了其最適pH，取0.5μL酶液，1μL甲醇配制的濃度為1×104mg/L的甲基對硫磷母液，加入到98.5μL Tris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中混勻，28℃反應30min后檢測405nm下的吸光度值；在酶促反應體系中分別加入不同金屬離子及化學試劑，各種化合物的終濃度為1mmol/L，28℃下反應30min后檢測405nm下的吸光度值，以研究不同金屬離子及化學試劑對酶反應的影響。

1.2.7 降解甲基對硫磷的動力學分析 將不同濃度的甲基對硫磷（25、50、100、200和400mg/L）作為底物，加入到50mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液體系中，在28℃下測酶反應速度，按雙倒數作圖法（Lineweaver-Burk法）求Km和Vm。

1.2.8 MPH和OPHC2的比較分析 對幾種常見的有機磷農藥降解酶基因基因進行分析，用MEGA 5.2構建系統進化樹；用Swiss-PdbViewer 4.1.0對MPH和OPHC2蛋白結構進行分析。

2 結果

2.1 目的基因的獲得與重組質粒的驗證

以Pseudomonas stutzeri YC-YH1的基因組DNA為模板，擴增獲得兩個目的基因，其大小與基因組測序基因大小一致（圖1-A）。將擴增獲得的mpd和ophc2基因片段純化后，用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切，與載體pET-32a連接并轉化E.coli BL21（DE3），在含有100mg/L氨芐青霉素抗性平板上篩選轉化子，提取質粒酶切驗證，并分別以pET-mpd和pET-ophc2為模板進行PCR驗證，與預測結果相符（圖1-B、圖 1-C）。

2.2 酶蛋白MPH和OPHC2的純化

將未進行誘導的全細胞蛋白、誘導后的全細胞蛋白及純化后的MPH和OPHC2蛋白同時進行SDSPAGE電泳，結果證明純化后的酶為單一條帶（圖2）。對純化的酶進行蛋白定量，得到MPH濃度為1.012mg/mL，OPHC2濃度為1.028 9mg/mL。

2.3 酶學性質的研究

2.3.1 MPH酶和OPHC2酶反應最適溫度 溫度對酶活力有重要影響，太高的溫度會使得蛋白變性，從而使酶失活，太低的溫度又會降低酶的活性，因此只有在最適溫度下純化酶才能發揮出最高活性。MPH酶在不同溫度下具有不同的活性，MPH對甲基對硫磷的最適反應溫度為40℃左右。溫度低于40℃時，酶的活性隨著溫度的升高而逐步上升，但超過40℃酶活力迅速下降，到80℃時酶已經失活。結果表明此酶在室溫下有較高的活性，但耐熱能力較差，高溫時降解能力明顯較弱。OPHC2酶的最適反應溫度為30℃左右。在20-30℃的溫度范圍內，酶的活力沒有明顯的變化，超過30℃以后，酶的活力開始下降，當超過40℃后，酶活力會急劇下降，在50℃時只有室溫時的60％?；旌厦傅淖钸m溫度也在30℃左右，混合酶在室溫時有較高的酶活，溫度上升到50℃時，酶活力下降到60％，這與單一純化酶相類似（圖3）。

圖1 PCR擴增結果及重組質粒驗證結果

圖2 MPH及OPHC2純化過程SDS-PAGE圖

圖3 溫度對酶反應的影響

圖4 pH對酶反應的影響

2.3.3 MPH、OPHC2及混合酶的動力學參數 以甲基對硫磷為底物，分別測定MPH、OPHC2及混合酶的動力學參數，利用雙倒數作圖法，求取Km和Vm值，結果見表2。

表2 MPH、OPHC2及混合酶的動力學參數

2.3.4 金屬離子及有機試劑對酶活的影響 不同的金屬離子和有機試劑會對酶組分產生不同的影響，從而促進或抑制酶的作用。由表3可以看出，有機試劑SDS和EDTA對酶活的影響最大，是MPH和OPHC2的強變性劑。SDS是一種表面活性劑，它是兩親性分子，會使蛋白質變性，所以加入后酶會失活；EDTA是一種絡合劑，可與金屬離子形成絡合物，MPH和OPHC2均金屬酶，加入EDTA會與酶活性中心的金屬離子螯合，從而降低了酶的活性。不同的金屬離子會對酶的活性產生不同的影響。Co2+對MPH的活性有一定促進作用，但同時會對OPHC2的活性產生抑制作用。其他各種金屬離子對MPH和OPHC2均表現出抑制作用，其中Zn2+的抑制作用最強。已有文獻報道，MPH活性中心的金屬離子為Zn2+，晶體狀態時每個活性中心的一個Zn2+可被Cd2+取代。OPHC2的活性中心有Zn2+還可能有Co2+或者Fe2+。加入Zn2+可能使得Zn2+過量從而對酶的活性產生強烈抑制?；旌厦富钚韵鄬Ψ€定，受各種金屬離子的影響較小，能夠降低添加的金屬離子對酶活力的抑制作用。

2.4 MPH與OPHC2的比較分析

對常見的幾種有機磷農藥降解酶基因進行比較分析，用MEGA 5.2構建系統進化樹（圖5）?？梢妋pd和ophc2相似性較高，親緣關系較近。

MPH與OPHC2都屬于β-內酰胺酶，屬于典型的β/α（TIM）折疊桶結構，活性位點均有兩個金屬離子，其催化機制也類似。MPH 的晶體結構為同源二聚體，包含A，B兩條鏈；OPHC2的晶體結構有A、B、C、D和E 5條鏈，其中包括兩個二聚體和一個單體（圖6）。MPH每個單體中含有45個氫鍵和8個鹽橋。OPHC2單體的N端與另一單體相互作用，單體間相互作用強烈，有29個氫鍵和15個鹽橋，涉及61個氨基酸殘基。同時OPHC2的每個單體還有一個二硫鍵（Cys110-Cys146），可能使OPHC2有更好的熱穩定性。

MPH每個單體通過 Asp151、His152、His302、His147、His149、His234和 Asp255與兩個金屬離子相連，一個H2O分子橋與兩個金屬離子相連，還有一個H2O分子只與一個金屬離子配位。OPHC2單體中的兩個金屬離子α和β，His294、His144、Asp143、Asp247與α 金 屬 離 子 作 用，His226、His139、His141 還有一個H2O分子與β離子作用。

表3 不同金屬離子及有機試劑對酶解反應的影響

圖6 MPH與OPHC2三維結構圖

用Swiss-PdbViewer 4.1.0對MPH和OPHC2的單體進行分析（圖7），其三維結構相似性很高，與之前的報道一致。由圖7中可以看到，MPH的Gln173-Phe178，Gln182-Asp186，Phe196-Ala210形 成 3個α螺旋，Lys214-Phe216形成β折疊，此段區域在OPHC2中不存在，可能會對酶的性質有一定影響。

A：MPH單體；B：OPHC2單體；C：MPH單體與OPHC2單體重疊比較

3 討論

本研究將來源于施氏假單胞菌YC-YH1的mpd和ophc2基因克隆到大腸桿菌中，并成功進行了誘導表達，得到了有功能活性的蛋白，通過親和層析的方法對蛋白進行純化，得到了高純度高濃度的目的蛋白，對單一純化酶和混合酶的酶學性質進行了初步研究。

楚曉娜等［22］報道其純化的的MPH在pH9-12范圍內能夠表現出較高的活力水平，最高活力的反應溫度為40℃。在本研究中純化的MPH的最適反應溫度也為40℃，最適pH為9，在pH9-12范圍酶活力同樣較高。伍寧豐等對純化的OPHC2進行酶學性質分析，其降解甲基對硫磷的最適溫度為65℃，最適pH為9［24］，本研究中純化的OPHC2最適反應溫度為30℃，更加接近自然環境溫度，最適pH為10，在pH8-12范圍內酶活一直較高，具有較好的pH適應性。MPH和OPHC2組成的混合酶在30-40℃范圍內具有很高的酶活性，在pH9-10范圍內其活力仍保持在最高水平。可以看出混合酶能夠更好地適應小范圍內溫度和pH的變化，使酶活力保持在最高水平。不同金屬離子及化學試劑對兩種酶的的活性都有一定影響，很多金屬離子都會降低酶的活性，SDS和EDTA會使酶完全失活。比較二者對底物甲基對硫磷的降解效率發現，MPH對甲基對硫磷的親和力高于OPHC2，而OPHC2對甲基對硫磷的降解最大速率高于MPH。混合酶對甲基對硫磷親和力雖然降低，但最大反應速率明顯升高。

MPH與OPHC2酶性質相似，OPHC2的結構表明其更強的熱穩定性［25］。通過對酶性質的研究，可以根據其特點定向對酶進行改造，提高降解效率和穩定性。酶工程正在迅速發展，也逐漸應用到人們的生活中。利用酶的進化和改造，使其應用到解決農藥污染和環境防治中具有十分重要的意義。

4 結論

株有機磷降解菌施氏假單胞菌 Pseudomonas stetzeri YC-YH1中產生的兩種降解酶MPH和OPHC2性質相似，共同作用時混合酶比單一的降解酶具有更好的溫度和pH適應性，對金屬離子和有機試劑的抑制作用也具有較強的抗性，同時最高反應速率也顯著增大。

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