pEZRThr567在肺鱗癌中的表達及臨床病理學意義*

張源，金承龍，王申桐，楊洋，林貞花，金鐵峰△(延邊大學腫瘤研究所，附屬醫院皮膚科，吉林延吉3300)

pEZRThr567在肺鱗癌中的表達及臨床病理學意義*

張源1▲，金承龍2▲，王申桐1，楊洋1，林貞花1，金鐵峰1△
(延邊大學1腫瘤研究所，2附屬醫院皮膚科，吉林延吉133002)

目的:探討第567位蘇氨酸磷酸化的埃茲蛋白(pEZRThr567)在肺鱗癌、癌旁及正常肺組織中的表達及其臨床病理學意義。方法:用免疫組化法檢測pEZRThr567在肺癌、癌旁及正常肺組織中的表達，并分析其異常表達與臨床病理學特點之間的相關性;用免疫熒光染色法檢測pEZRThr567在肺鱗癌細胞EBC-1中的定位情況。結果: pEZRThr567蛋白在肺鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁組織和正常肺組織(P＜0.01);pEZRThr567蛋白主要表達于細胞膜，且其表達與腫瘤分化程度、臨床分期和有無淋巴結轉移密切相關(P＜0.05)。結論:pEZRThr567蛋白可作為肺鱗癌惡性進展的有效分子指標。

肺鱗癌;埃茲蛋白;免疫組織化學

［ABSTRACT］AIM:To investigate the clinicopathological significance of the protein expression of phosphorylated ezrin at threonine 567(pEZRThr567)in lung squamous cell carcinoma，adjacent tissues and normal tissues.METHODS: pEZRThr567protein was detected in lung squamous carcinoma，adjacent and normal tissues by the method of immunohistochemistry.The correlation of pEZRThr567expression with clinicopathological parameters of lung squamous carcinomaswas also analyzed.The localization of pEZRThr567was detected by immunofluorescence staining in lung squamous cell line EBC-1.RESULTS:The protein expression of pEZRThr567in lung squamous carcinomawas significantly higher than that in the adjacent and normal lung tissues(P＜0.01).pEZRThr567mainly localized on the cellmembrane，and its over-expression significantly correlated with the differentiation，clinical stage and lymph node metastasis in lung squamous carcinoma.CONCLUSION:pEZRThr567may be an effective biomarker for prediction ofmalignant potential and poor prognosis of lung cancer.

［KEY WORDS］Lung squamous carcinoma;Ezrin;Immunohistochemistry

肺癌居于惡性腫瘤死亡率首位［1］，鱗癌為最常見的類型之一［2］。細胞膜骨架連接蛋白埃茲蛋白(ezrin，EZR)屬于埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)家族成員，可維持細胞的正常形態和運動能力［3］。目前大多數的研究表明EZR蛋白在肺癌中高表達，但國內Chen等［4］認為EZR在肺癌中表達下調。雖然EZR在肺癌的表達研究國內外已有報道，但作用機制仍不明確，而EZR的活化形式即磷酸化EZR在肺癌尤其是肺鱗癌的表達研究國內外未見報道。本文旨在探討磷酸化EZR蛋白在肺鱗癌、癌旁組織及正常肺組織的表達情況并分析其臨床病理學意義，為肺鱗癌的早期診斷提供可靠的分子標志物。

材料和方法

1材料

135例肺鱗癌及其癌旁組織來源于吉林大學第二人民醫院和承德醫學院附屬醫院病理科，14例正常肺組織來源于延邊大學醫學院病理學教研室尸檢存檔蠟塊。肺鱗癌細胞株EBC-1購于ATCC。免疫組化SP兩步法檢測試劑盒為Dako產品;免疫熒光染色試劑盒購自Invitrogen;phospho-EZR-Thr567 (pEZRThr567)抗體購自Signalway Antibody。

2方法

2.1免疫組化染色石蠟組織以4μm連續切片，pEZRThr567(1∶100)4℃孵育過夜，以標記辣根過氧化物酶的抗兔Ⅱ抗室溫孵育45 min，DAB顯色，Mayer蘇木素復染。為證明EZR蛋白抗體免疫組化檢測的特異性，分別以PBS代替I抗作為空白對照，并以已知pEZRThr567陽性著色的切片為陽性對照。免疫組化染色以棕色或金黃色著色判定為陽性染色結果，并根據陽性細胞數的比例將染色結果分為4級。0級為陽性細胞數占0～5%;1級為陽性細胞數占6%～25%;2級為陽性細胞數占26%～50%;3級為陽性細胞數占51%～75%;4級為陽性細胞數占75%以上。

2.2免疫熒光染色人肺鱗癌細胞株EBC-1常規培養至細胞融合度達到90%，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100打孔，BSA封閉，PBS洗滌，pEZRThr567Ⅰ抗(1∶100)室溫孵育2 h，Alexa Fluor?488山羊抗兔IgG熒光II抗室溫孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

3統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計數資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1pEZRThr567蛋白在肺鱗癌組織中高表達并主要定位于細胞膜

免疫染色表明，pEZRThr567主要表達于細胞膜及絲狀偽足，pEZRThr567在135例的肺鱗癌組織中有107例(79.3%)陽性表達，遠高于癌旁組織的67例(13.4%)及正常肺組織的14例(14.3%)，組間比較差異顯著(P＜0.01)。同時分析pEZRThr567蛋白定位情況發現其定位于細胞膜及細胞漿，在107例陽性表達的肺鱗癌組織中，細胞膜的表達有86例(80.4%)，而細胞漿的表達為21例(19.6%)，遠低于在細胞膜中的表達，且在細胞膜的染色強度高于在細胞漿的染色強度(P＜0.01)，見圖1、2。

Figure 1.The expression of the pEZRThr567in normal lung tissues，adjacent lung tissues and lung squamous carcinoma(×200).A:normal lung tissue;B:adjacent lung tissue;C:weakly positive pEZRThr567location on cytoplasm in squamous carcinoma;D:strongly positive pEZRThr567location onmembrane in squamous carcinoma.圖1　pEZRThr567在正常肺組織、癌旁組織及肺鱗癌組織中的表達

Figure 2.The pEZRThr567distributed on the cellmembrane，cytoplasm and filopodia，but the distribution on the cellmembrane is furthermore than that on the cytoplasm(×200).圖2　pEZRThr567在EBC-1細胞分布的定位分析

2pEZRThr567膜陽性表達與肺鱗癌臨床病理因素之間的關系

pEZRThr567膜陽性表達與腫瘤分化程度、臨床分期及有無淋巴結轉移密切相關，但與患者的性別、年齡、腫瘤大小及是否吸煙不相關，見表1。

討論

EZR是ERM蛋白家族成員之一，它通過連接細胞膜與細胞骨架來維持細胞的形態和生存能力，對細胞的黏附、分化、運動等起重要調節作用［5］。研究表明，EZR的表達與腫瘤轉移密切相關［6-8］。雖然多數研究認為EZR蛋白在肺癌中高表達，但也有研究證實EZR蛋白在肺癌中呈低表達。對于2種不同的結果，可能與選擇病例人群、標本例數、統計方法及結果判定標準不同等因素有關。但有關磷酸化EZR的作用機制國內外研究較少，尤其是磷酸化的EZR在肺鱗癌的表達研究未見報道。有研究表明EZR在經過磷酸化修飾后可從休眠狀態變為活化狀態，并從細胞質向細胞膜定向遷移，完成其生理功能［9］。游昕超等［10］的最新研究證實，EZR蛋白的磷酸化程度決定乳腺癌細胞系MCF-7的遷移能力。另有研究表明EZR蛋白在卵巢癌的表達明顯高于癌旁正常組織，且有轉移組細胞膜陽性率顯著高于無轉移組［11］。我們之前的研究表明EZR及其磷酸化蛋白在非小細胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)呈顯著高表達并與NSCLC的惡性進展密切相關，而EZR、pEZRTyr353及pEZRThr567中只有pEZRThr567與NSCLC的淋巴結轉移具有相關性［12］。一項來自于骨肉瘤的研究同樣也表明在EZR、pEZRTyr354及pEZRThr567中只有pEZRThr567表達于細胞膜并與轉移密切相關［13］。因此，pEZRThr567可能更適合作為肺鱗癌的分子標志物。Antelmi等［14］的研究證實pEZRThr567蛋白在乳腺癌中高表達，主要定位于細胞膜及偽足。通過應用pEZRThr567點突變干擾方法，使其表達下調后發現細胞侵襲能力及偽足形成率明顯減少，這與我們的研究結果基本符合。在本研究中我們通過免疫組化及免疫熒光染色發現，pEZRThr567蛋白在細胞膜及由細胞伸出的絲狀偽足上密集分布，而細胞的遷移通常是從伸出絲狀/板狀偽足后細胞變形，繼而以阿米巴樣運動開始的。Antelmi等［14］的研究最終證實pEZRThr567與β1整合素結合后促進偽足的形成并最終活化細胞的遷移能力。而pEZRThr567在肺癌，尤其是肺鱗癌的轉移過程中是通過哪種渠道起作用的還不得而知，需要更深入的研究。本研究表明，pEZRThr567在肺鱗癌中的表達明顯高于癌旁和正常肺組織;在晚期肺鱗癌、有淋巴結轉移的肺鱗癌及中低分化肺鱗癌組中其表達明顯增高。這提示pEZRThr567的膜陽性表達對于肺癌的惡性進展具有重要的判定價值。

表1　pEZRThr567膜陽性表達與肺鱗癌臨床病理參數之間的關系Table 1.Correlation between expression of pEZRThr567onmembrane and clinicopathological parameters of lung squamous carcinoma

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Clinicopathological significance of pEZRThr567expression in lung squamous carcinoma

ZHANG Yuan1，JIN Cheng-long2，WANG Shen-tong1，YANG Yang1，LIN Zhen-hua1，JIN Tie-feng1
(1Cancer Research Center，2Department of Dermatology，Affiliated Hospital，Yanbian University，Yanji133002，China.E-mail:jintf@ybu.edu.cn)

R734.2;R730.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.032

1000-4718(2015)05-0947-04

2014-12-14［修回日期］2015-02-10

國家自然科學基金資助項目(No.61371067)

Tel:0433-2435060;E-mail:jintf@ybu.edu.cn

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