pEZRThr567在肺鱗癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義*

張?jiān)矗鸪旋垼跎晖瑮钛螅重懟ǎ痂F峰△(延邊大學(xué)腫瘤研究所，附屬醫(yī)院皮膚科，吉林延吉3300)

pEZRThr567在肺鱗癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義*

張?jiān)?▲，金承龍2▲，王申桐1，楊洋1，林貞花1，金鐵峰1△
(延邊大學(xué)1腫瘤研究所，2附屬醫(yī)院皮膚科，吉林延吉133002)

目的:探討第567位蘇氨酸磷酸化的埃茲蛋白(pEZRThr567)在肺鱗癌、癌旁及正常肺組織中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義。方法:用免疫組化法檢測(cè)pEZRThr567在肺癌、癌旁及正常肺組織中的表達(dá)，并分析其異常表達(dá)與臨床病理學(xué)特點(diǎn)之間的相關(guān)性;用免疫熒光染色法檢測(cè)pEZRThr567在肺鱗癌細(xì)胞EBC-1中的定位情況。結(jié)果: pEZRThr567蛋白在肺鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肺組織(P＜0.01);pEZRThr567蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜，且其表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論:pEZRThr567蛋白可作為肺鱗癌惡性進(jìn)展的有效分子指標(biāo)。

肺鱗癌;埃茲蛋白;免疫組織化學(xué)

［ABSTRACT］AIM:To investigate the clinicopathological significance of the protein expression of phosphorylated ezrin at threonine 567(pEZRThr567)in lung squamous cell carcinoma，adjacent tissues and normal tissues.METHODS: pEZRThr567protein was detected in lung squamous carcinoma，adjacent and normal tissues by the method of immunohistochemistry.The correlation of pEZRThr567expression with clinicopathological parameters of lung squamous carcinomaswas also analyzed.The localization of pEZRThr567was detected by immunofluorescence staining in lung squamous cell line EBC-1.RESULTS:The protein expression of pEZRThr567in lung squamous carcinomawas significantly higher than that in the adjacent and normal lung tissues(P＜0.01).pEZRThr567mainly localized on the cellmembrane，and its over-expression significantly correlated with the differentiation，clinical stage and lymph node metastasis in lung squamous carcinoma.CONCLUSION:pEZRThr567may be an effective biomarker for prediction ofmalignant potential and poor prognosis of lung cancer.

［KEY WORDS］Lung squamous carcinoma;Ezrin;Immunohistochemistry

肺癌居于惡性腫瘤死亡率首位［1］，鱗癌為最常見(jiàn)的類型之一［2］。細(xì)胞膜骨架連接蛋白埃茲蛋白(ezrin，EZR)屬于埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)家族成員，可維持細(xì)胞的正常形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力［3］。目前大多數(shù)的研究表明EZR蛋白在肺癌中高表達(dá)，但國(guó)內(nèi)Chen等［4］認(rèn)為EZR在肺癌中表達(dá)下調(diào)。雖然EZR在肺癌的表達(dá)研究國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，但作用機(jī)制仍不明確，而EZR的活化形式即磷酸化EZR在肺癌尤其是肺鱗癌的表達(dá)研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在探討磷酸化EZR蛋白在肺鱗癌、癌旁組織及正常肺組織的表達(dá)情況并分析其臨床病理學(xué)意義，為肺鱗癌的早期診斷提供可靠的分子標(biāo)志物。

材料和方法

1材料

135例肺鱗癌及其癌旁組織來(lái)源于吉林大學(xué)第二人民醫(yī)院和承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，14例正常肺組織來(lái)源于延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室尸檢存檔蠟塊。肺鱗癌細(xì)胞株EBC-1購(gòu)于ATCC。免疫組化SP兩步法檢測(cè)試劑盒為Dako產(chǎn)品;免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自Invitrogen;phospho-EZR-Thr567 (pEZRThr567)抗體購(gòu)自Signalway Antibody。

2方法

2.1免疫組化染色石蠟組織以4μm連續(xù)切片，pEZRThr567(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，以標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的抗兔Ⅱ抗室溫孵育45 min，DAB顯色，Mayer蘇木素復(fù)染。為證明EZR蛋白抗體免疫組化檢測(cè)的特異性，分別以PBS代替I抗作為空白對(duì)照，并以已知pEZRThr567陽(yáng)性著色的切片為陽(yáng)性對(duì)照。免疫組化染色以棕色或金黃色著色判定為陽(yáng)性染色結(jié)果，并根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例將染色結(jié)果分為4級(jí)。0級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占0～5%;1級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占6%～25%;2級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占26%～50%;3級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占51%～75%;4級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占75%以上。

2.2免疫熒光染色人肺鱗癌細(xì)胞株EBC-1常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100打孔，BSA封閉，PBS洗滌，pEZRThr567Ⅰ抗(1∶100)室溫孵育2 h，Alexa Fluor?488山羊抗兔IgG熒光II抗室溫孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1pEZRThr567蛋白在肺鱗癌組織中高表達(dá)并主要定位于細(xì)胞膜

免疫染色表明，pEZRThr567主要表達(dá)于細(xì)胞膜及絲狀偽足，pEZRThr567在135例的肺鱗癌組織中有107例(79.3%)陽(yáng)性表達(dá)，遠(yuǎn)高于癌旁組織的67例(13.4%)及正常肺組織的14例(14.3%)，組間比較差異顯著(P＜0.01)。同時(shí)分析pEZRThr567蛋白定位情況發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，在107例陽(yáng)性表達(dá)的肺鱗癌組織中，細(xì)胞膜的表達(dá)有86例(80.4%)，而細(xì)胞漿的表達(dá)為21例(19.6%)，遠(yuǎn)低于在細(xì)胞膜中的表達(dá)，且在細(xì)胞膜的染色強(qiáng)度高于在細(xì)胞漿的染色強(qiáng)度(P＜0.01)，見(jiàn)圖1、2。

Figure 1.The expression of the pEZRThr567in normal lung tissues，adjacent lung tissues and lung squamous carcinoma(×200).A:normal lung tissue;B:adjacent lung tissue;C:weakly positive pEZRThr567location on cytoplasm in squamous carcinoma;D:strongly positive pEZRThr567location onmembrane in squamous carcinoma.圖1　pEZRThr567在正常肺組織、癌旁組織及肺鱗癌組織中的表達(dá)

Figure 2.The pEZRThr567distributed on the cellmembrane，cytoplasm and filopodia，but the distribution on the cellmembrane is furthermore than that on the cytoplasm(×200).圖2　pEZRThr567在EBC-1細(xì)胞分布的定位分析

2pEZRThr567膜陽(yáng)性表達(dá)與肺鱗癌臨床病理因素之間的關(guān)系

pEZRThr567膜陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與患者的性別、年齡、腫瘤大小及是否吸煙不相關(guān)，見(jiàn)表1。

討論

EZR是ERM蛋白家族成員之一，它通過(guò)連接細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架來(lái)維持細(xì)胞的形態(tài)和生存能力，對(duì)細(xì)胞的黏附、分化、運(yùn)動(dòng)等起重要調(diào)節(jié)作用［5］。研究表明，EZR的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6-8］。雖然多數(shù)研究認(rèn)為EZR蛋白在肺癌中高表達(dá)，但也有研究證實(shí)EZR蛋白在肺癌中呈低表達(dá)。對(duì)于2種不同的結(jié)果，可能與選擇病例人群、標(biāo)本例數(shù)、統(tǒng)計(jì)方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)不同等因素有關(guān)。但有關(guān)磷酸化EZR的作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外研究較少，尤其是磷酸化的EZR在肺鱗癌的表達(dá)研究未見(jiàn)報(bào)道。有研究表明EZR在經(jīng)過(guò)磷酸化修飾后可從休眠狀態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，并從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜定向遷移，完成其生理功能［9］。游昕超等［10］的最新研究證實(shí)，EZR蛋白的磷酸化程度決定乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的遷移能力。另有研究表明EZR蛋白在卵巢癌的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且有轉(zhuǎn)移組細(xì)胞膜陽(yáng)性率顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移組［11］。我們之前的研究表明EZR及其磷酸化蛋白在非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)呈顯著高表達(dá)并與NSCLC的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，而EZR、pEZRTyr353及pEZRThr567中只有pEZRThr567與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性［12］。一項(xiàng)來(lái)自于骨肉瘤的研究同樣也表明在EZR、pEZRTyr354及pEZRThr567中只有pEZRThr567表達(dá)于細(xì)胞膜并與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13］。因此，pEZRThr567可能更適合作為肺鱗癌的分子標(biāo)志物。Antelmi等［14］的研究證實(shí)pEZRThr567蛋白在乳腺癌中高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜及偽足。通過(guò)應(yīng)用pEZRThr567點(diǎn)突變干擾方法，使其表達(dá)下調(diào)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞侵襲能力及偽足形成率明顯減少，這與我們的研究結(jié)果基本符合。在本研究中我們通過(guò)免疫組化及免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，pEZRThr567蛋白在細(xì)胞膜及由細(xì)胞伸出的絲狀偽足上密集分布，而細(xì)胞的遷移通常是從伸出絲狀/板狀偽足后細(xì)胞變形，繼而以阿米巴樣運(yùn)動(dòng)開(kāi)始的。Antelmi等［14］的研究最終證實(shí)pEZRThr567與β1整合素結(jié)合后促進(jìn)偽足的形成并最終活化細(xì)胞的遷移能力。而pEZRThr567在肺癌，尤其是肺鱗癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中是通過(guò)哪種渠道起作用的還不得而知，需要更深入的研究。本研究表明，pEZRThr567在肺鱗癌中的表達(dá)明顯高于癌旁和正常肺組織;在晚期肺鱗癌、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌及中低分化肺鱗癌組中其表達(dá)明顯增高。這提示pEZRThr567的膜陽(yáng)性表達(dá)對(duì)于肺癌的惡性進(jìn)展具有重要的判定價(jià)值。

表1　pEZRThr567膜陽(yáng)性表達(dá)與肺鱗癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1.Correlation between expression of pEZRThr567onmembrane and clinicopathological parameters of lung squamous carcinoma

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Clinicopathological significance of pEZRThr567expression in lung squamous carcinoma

ZHANG Yuan1，JIN Cheng-long2，WANG Shen-tong1，YANG Yang1，LIN Zhen-hua1，JIN Tie-feng1
(1Cancer Research Center，2Department of Dermatology，Affiliated Hospital，Yanbian University，Yanji133002，China.E-mail:jintf@ybu.edu.cn)

R734.2;R730.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.032

1000-4718(2015)05-0947-04

2014-12-14［修回日期］2015-02-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.61371067)

Tel:0433-2435060;E-mail:jintf@ybu.edu.cn

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