回神顆粒對APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠A沉積的影響

張玉嶺，劉 丹，陳寶貴*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700）

回神顆粒對APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠A沉積的影響

張玉嶺1，劉 丹2，陳寶貴2*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700）

目的 研究回神顆粒對APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠細胞凋亡及相關(guān)基因表達的影響。方法 通過Morris水迷宮的方法檢測小鼠行為學(xué)變化，HE染色觀察各組海馬神經(jīng)細胞形態(tài)，免疫組化方法檢測小鼠海馬區(qū)Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP的表達。結(jié)果 中藥回神顆粒能降低APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠腦組織的A沉積（P＜0.01），提高腦組織中SorLA表達、降低Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 回神顆粒可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)SorLA、胞膜Caveolin-1蛋白的表達進而抑制Aβ生成、沉積等病理改變，防治阿爾茨海默病。

阿爾茨海默病;回神顆粒;細胞凋亡

阿爾茨海默病（alzheimer's disease，AD）以記憶、思維、行為障礙為特征，是一種進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，占老年性癡呆的60% ～80%［1-2］。研究［3-6］提示，一種叫做β-淀粉樣蛋白的蛋白質(zhì)在腦內(nèi)的沉積會引起神經(jīng)細胞變性壞死最終導(dǎo)致阿爾茨海默病。回神顆粒具有補益五臟精氣之功，課題組前期研究結(jié)果表明，回神顆粒對AD細胞模型有較好的療效，對細胞凋亡有抑制作用。本研究選用APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠［7］，觀察回神顆粒對其腦組織AD相關(guān)基因表達的影響，進一步揭示其防治AD的機制。

1 材料

1.1 藥物 回神顆粒由人參、石菖蒲、鹿角、靈芝、丹參、五味子、川芎等藥物組成，為武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑。

1.2 試劑與儀器 Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP 等單克隆抗體、二抗等，Western Blot相關(guān)試劑均從國外進口，其他試劑均為分析純。Olympus顯微鏡、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)、凝膠圖象分析系統(tǒng)、多功能電泳儀、Morris水迷宮等。

1.3 動物 雄性SPF級APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠24只，6月齡，由中國中醫(yī)科學(xué)院動物研究所提供。同背景、同月齡的野生型小鼠8只。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠平均分為3組:模型組、空白組、中藥組，每組8只;同背景、同月齡的野生型小鼠為空白組。中藥組每天給予回神顆粒0.031 g/mL灌胃，正常組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃共4周。

2.2 取材 斷頭取腦，左側(cè)腦組織，置于4%多聚甲醛中固定;右側(cè)腦組織，置于液氮中備用，每組隨機取4只進行HE檢測和免疫組化檢測。

2.3 Morris水迷宮實驗［8-9］水池高度（約24 cm），水溫控制在23～25℃。在池壁上以不同形狀的標志物標記4個象限的入水點，實驗數(shù)據(jù)分別記錄東、南、西、北4個標記點，第1天實驗前及最后1 d實驗結(jié)束后撤去平臺，將小鼠放入水池中自由游泳60 s，以檢測各組小鼠間的游泳速度有無差異。整個測試共6 d，前5 d為隱蔽站臺實驗，第6天為空間探索實驗。

2.4 HE檢測 常規(guī)石蠟，包埋、切片;切片常規(guī)75% ～100%梯度脫水，二甲苯媒浸，55～60°浸臘，石蠟包埋，切片（厚度4 iim），常規(guī)蘇木素-伊紅染色，脫水透明、封片;光鏡下分析結(jié)果。

2.5 免疫組化檢測 切片脫蠟入水，0.3%H2O237℃作用10 min，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）微波（95～98℃）加熱處理20 min，冷卻至室溫，PBS（pH 7.4）洗5 min，3次。加羊血清封閉，37℃ 5 min。滴加兔抗多克隆 Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP 抗體，37 ℃孵育2 h，PBS 洗5 min，3次，加羊抗兔IgU 37℃ 20 min，PBS洗5 min，3次。滴加DAB復(fù)合物顯色。10 min后流水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染5 min。烤干后封片。正常對照組用PBS代替一抗，其他步驟與以上程序相同。每只動物各取1張免疫組化切片，在低倍鏡（10×10）下觀察腦片，然后在高倍鏡（40×40）下隨機選取海馬、大腦皮層5個視野，進行圖像分析測定平均陽性細胞數(shù)及陽性細胞平均光密度。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，應(yīng)用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析。進行方差齊性、正態(tài)分布檢驗，選用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 回神顆粒對小鼠行為學(xué)的影響 見表1、表2。

3.2 回神顆粒對小鼠腦組織AD沉積的影響 見表3。

3.3 回神顆粒對小鼠腦組織中AD相關(guān)基因表達的影響 見表4。

4 討論

回神顆粒源自名醫(yī)張錫純，1939年張先生逝世前將其傳給弟子柳學(xué)洙，經(jīng)柳老臨床應(yīng)用40余載，療效肯定。遂將本方傳給導(dǎo)師陳寶貴教授，導(dǎo)師陳寶貴教授又進行20年臨床驗證后將湯劑改為顆粒劑并在藥味上加以修改。作為臨床和實驗研究的科研用藥。在治療創(chuàng)傷性腦損傷、腦梗死、腦出血、各種癡呆等神經(jīng)疾病方面都取得良好的療效。方中人參，入脾胃二經(jīng)，大補元氣，固脫生津安神。石菖蒲入心、肺、脾三經(jīng)，開竅豁痰，芳香醒神。鹿角溫補肝腎，活血消腫。靈芝入脾腎，滋補強壯，安神。五味子酸溫入肺腎，斂肺滋陰、安神，其浸膏對中樞神經(jīng)有強壯作用，改善智力活動，促進基礎(chǔ)代謝。川芎、丹參行氣活血，丹參苦涼入心肝經(jīng)，消離經(jīng)之血，川芎乃血中氣藥，助清陽而開諸郁。現(xiàn)代藥理研究表明:人參具有抗腦細胞凋亡之功效，減輕腦水腫，可雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和抑制過程［10］。石菖蒲、丹參、川芎具有改善腦微循環(huán)，抗自由基損傷，誘導(dǎo)自由基清除酶SOD升高以及該酶的活性恢復(fù)，減少MDA過度生成造成的鈣內(nèi)流引起的神經(jīng)細胞凋亡，減輕腦水腫，降低顱內(nèi)壓［11］。五味子的有效成分五味子酚對氧自由基引起的大腦突觸體和線粒體損傷有明顯的保護作用［12-13］。

表1 回神顆粒對APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠隱藏平臺實驗中搜索平臺潛伏期能力的影響（±s，n=8）

表1 回神顆粒對APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠隱藏平臺實驗中搜索平臺潛伏期能力的影響（±s，n=8）

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別逃避潛伏期/s第1天 第2天 第3天 第4天 第5天模型組 63.000 0± 0.0 38.762 5±25.872 11 46.056 3±25.307 92## 30.831 2±25.961 57## 26.837 5±22.896 70##中藥組 62.181 2± 4.631 55 33.706 3±27.380 90 19.385 0±16.817 43△△ 5.837 5± 5.916 18△△ 4.960 0± 3.587 68△△正常組 43.698 8±25.269 14 39.427 5±24.554 74 19.385 0±16.817 43 5.837 5±5.916 18 4.960 0±3.587 68

表2 回神顆粒對APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響（±s，n=8）

表2 回神顆粒對APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響（±s，n=8）

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 穿越平臺次數(shù)/次模型組 0.500±0.547 7##中藥組 3.714±2.430 0△△正常組 4.143±1.864 0

表3 回神顆粒對癡呆小鼠海馬區(qū)陽性細胞數(shù)的影響（±s，n=8）

表3 回神顆粒對癡呆小鼠海馬區(qū)陽性細胞數(shù)的影響（±s，n=8）

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 Aβ1-42陽性細胞數(shù)/個正常組 2.8±6.1中藥組 9.5±3.1△△模型組 14.6±4.5##

表4 各組小鼠腦組織AD相關(guān)蛋白表達情況（±s，n=8）個

表4 各組小鼠腦組織AD相關(guān)蛋白表達情況（±s，n=8）個

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 SorLA陽性細胞數(shù) Caveolin-1陽性細胞數(shù) BACE1陽性細胞數(shù) PS-1陽性細胞數(shù) APP 陽性細胞數(shù)正常組 15.2±5.3 3.7±4.6 6.8±4.5 5.6±5.4 4.8±6.1中藥組 13.5±4.2△△ 5.6±2.3△△ 8.9±3.4△△ 7.2±4.5△△ 6.5±3.1△△模型組 7.5±5.4## 11.8±3.5## 15.7±3.6## 16.8±6.2## 14.6±4.5##

本研究從A沉積在阿爾茨海默病中的作用及與AD的關(guān)系角度探討回神顆粒對阿爾茨海默病動物模型的干預(yù)作用。為中醫(yī)藥干預(yù)阿爾茨海默病充實豐富的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床防治老年性癡呆性疾病選方用藥提供新思路。

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［1］BERCHTOLD N C，COTMAN C W.Evolution in the conceptualization of dementia and Alzheimer's disease:Greco-Roman period to the 1960s［J］.Neurobiology of Aging，1998，19（3）:173-189.

［2］BROOKMEYER R，JOHNSON E，ZIEGLER-GRAHAM K，et al.Forecasting the global burden of Alzheimer's disease.Alzheimer's＆Dementia.2007［J］.Retrieved 18 June，2008，3（3）:186-191.

［3］M?LS? P K，MARTTILA R J，RINNE U K.Survival and cause of death in Alzheimer's disease and multi-infarct dementia［J］.Acta Neurologica Scandinavica，1986，74（2）:103-107.

［4］MEEK P D，MCKEITHAN K，SCHUMOCK G T.Economic considerations in alzheimer's disease［J］.Pharmacotherapy，1998，18（2）:68.

［5］MUDHER A，LOVESTONE S.Alzheimer's disease-do tauists and baptists finally shake hands［J］.Trends in Neurosciences，2002，25（1）:22-26.

［6］LALONDE R，DUMONT M，STAUFENBIEL M，et al.Spatial learning，exploration，anxiety，and motor coordination in female APP23 transgenic mice with the Swedish mutation［J］.Brain Research，2002，956（1）:36-44.

［7］ANANTHARAMAN M，TANGPONG J，KELLER J N，et al.Betaamyloid mediated nitration of Manganese superoxide dismutase:implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease［J］.The American Journal of Pathology，2006，168（5）:1608-1618.

［8］羅小泉，駱利平，陳海芳，等.Morris水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）:2667-2669.

［9］薛丹，徐淑萍，劉進修，等.水迷宮實驗中三種品系小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較［J］.中國實驗動物學(xué)報，2010，18（2）:149-152.

［10］周志寬.益智中藥的現(xiàn)狀和開發(fā)［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，1995，2（2）:18-19，38.

［11］田金洲.血管性癡呆［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:230-233.

［12］許沛虎.中醫(yī)腦病學(xué)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1998:8.

［13］劉海東，李傳勇，陳慧鍋，等.回神顆粒治療重型顱腦創(chuàng)傷臨床療效觀察［J］.中醫(yī)腦病雜志，2006，6（2）:155-157.

Huishen granule on expression of APP/PS1/tau in hippocampus in three-transgenic AD mice

ZHANG Yuling1，LIU Dan2，CHEN Baogui2*
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China 2.Tianjin Wuqing District Hospital of TCM，Tianjin 301700，China）

ObjectiveTo explore the therapeutic effect of Huishenin granule on early-stage Alzheimer's disease（AD）in transgenosis AD mice.Methods Morris water maze（escape latency and crossing times）was applied to evaluate the learning and memory ability.Hematoxylin-Eosin（HE）staining was used to observe morphology changes in the brains of AD mice.Aβ1-42，SorLA，Caveolin-1，BACE1，PS-1 and APP protein in the area of hippocampus was detected by immunohistochemical method.ResultsAfter the treatment of grain-sized moxibustion，learning and memory ability in the treatment group was increased;compared with the model group，the escape latency was shorten and crossing times was increased.Compared with the normal group，the positive area and integral optical density of Caveolin-1，BACE1，PS-1，APP in hippocampus in the model group were increased（P ＜0.01）.Compared with the model group，the positive area and integral optical density of Caveolin-1，BACE1，PS-1，APP in hippocampus in the treatment group were reduced（P ＜0.05，P ＜0.01）.Conclusion The Huishen granule could significantly improve the learning and memory ability in APP/PS1/tau double-transgenic AD mice and inhibit the over expression and accumulation of Aβ，prevention and treatment of Alzheimer's disease.

Alzheimer's disease;Huishen granule;cell apoptosis

R285.5

A

2095-6258（2015）04-0683-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.04.008

全國名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項目［國中醫(yī)藥人教發(fā)（2011）41］。

張玉嶺（1986-），女，博士研究生，醫(yī)師，主要從事中醫(yī)腦病研究。

陳寶貴，碩士，教授，主任醫(yī)師，電子信箱-doczhangyuling@163.com

2015-01-23）