葛根芩連湯對高脂飼料飼喂的大鼠非酒精性脂肪性肝炎的實驗研究

宋紅梅　曲巖　李紹民等

[摘要] 目的 研究葛根芩連湯對大鼠NASH模型的藥效學作用。 方法 隨機將SD大鼠分為空白組、模型組、葛根芩連湯低劑量組、葛根芩連湯高劑量組，每組10只，然后建立大鼠NASH模型，造模同時進行藥物干預；實驗第8周結束后進行血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C、TNF-α、IL-6、IL-10及肝組織TNF-α、IL-6、IL-10的測定。 結果 （1）肝臟酶學：血清ALT、AST水平，模型組高于空白組（P<0.01），葛根芩連湯高、低劑量組低于模型組（P<0.05）。（2）血脂及肝脂：與空白組相比，模型組血清HDL-C顯著降低，血清LDL-C、TG、TC明顯增加（P<0.01）。葛根芩連湯高、低劑量組血清HDL-C水平與模型組相比增加，血清LDL-C、TG、TC均降低（P<0.05）。（3）血清及肝組織IL-6、IL-10、TNF-α水平：與空白組相比，模型組血清及肝組織IL-10顯著降低，血清IL-6、TNF-α明顯增加（P<0.01）。與模型組相比，葛根芩連湯高、低劑量組可明顯增加血清及肝組織IL-10含量，降低血清及肝組織IL-6、TNF-α水平（P<0.05）。 結論 葛根芩連湯高、低劑量均能夠降低高脂飲食飼喂誘導的NASH大鼠血清轉氨酶水平、改善血脂代謝紊亂；能夠通過提高抑炎因子和抑制促炎因子兩方面調控炎癥的發展。

[關鍵詞] 葛根芩連湯；大鼠NASH模型；藥效學

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）15-19-04

[Abstract] Objective To study the pharmacodynamic effects of Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction in rats NASH model. Methods To randomly divide the SD rats with blank group， model group， Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction low dose group， Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high dose group， with 10 rats in each group， then to establish rats NASH model， to build rats model meanwhile to carry out drug intervention. 8th weeks after completion of experiment， to mensurate the serum ALT， AST， TG， TC， HDL-C， LDL-C， TNF-α， IL-6， IL-10， and the hepatic tissue TNF-α， IL-6， IL-10. Results （1） Liver enzymology： The level of serum ALT and AST in model group were higher than which in blank group（P<0.01）， while which in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high dose group were lower than which in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction low dose group（P<0.05）. （2） Blood lipid and liver lipid： Compared with blank group， the level of serum HDL-C was significantly lower in model group， and the serum LDL-C， TG， TC were obviously increased in model group（P<0.01）. Compared with model group， the level of serum HDL-C in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose group were obviously increased， the serum LDL-C， TG， TC in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose group were obviously reduced（P<0.05）. （3） Serum and hepatic tissue IL-6， IL-10， TNF-α level： Compared with blank group， serum and hepatic tissue IL-10 in model group was significantly decreased， serum IL-6， TNF-α in model group were obviously increased（P<0.01）. Compared with model group， serum and hepatic tissue IL-10 in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose group was obviously increased， while serum and hepatic tissue IL-6， TNF-α were lower（P<0.05）. Conclusion Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose all could reduce the level of serum transaminase in NASH rats which was induced by the feeding of high fat diet， could improve the metabolism disorder of lipid， could regulate the development of inflammation through to improve anti-inflammatory cytokine and to inhibit promotion inflammation cytokine.endprint

[Key words] Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction； Rats NASH model； Pharmacodynamic

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與代謝相關的應激性肝損傷，主要特征是甘油三酯（TG）蓄積，包括單純性脂肪肝（NAFL）、脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化（NAFC）。研究表明，NAFLD已成為無癥狀性轉氨酶升高的首要原因[1-3]，同時又是肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥等代謝綜合征相關組分在肝臟的集中體現，嚴重威脅著人民的身體健康。從NAFL到NAFC的過程中，NASH起著限速的作用，是形成肝硬化的重要原因之一[4-5]。目前研究證實，中醫藥對NASH的防治具有全方位、多靶點的立體作用，還能針對發病的脂代謝紊亂、胰島素抵抗[6-7]、氧化應激和脂質過氧化損傷等多個環節的效應指標進行有效調節。現代研究表明，葛根芩連湯具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。所以本實驗選用葛根芩連湯干預高脂飼料誘導的NASH大鼠模型[8]，為開發防治NASH有效的中藥制劑提供新思路和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周雄性SD大鼠40只，體重約為（150±200）g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗中藥 處方飲片均購自北京同仁堂制藥集團哈爾濱藥店，依《傷寒論》生藥比例為葛根∶黃連∶黃芩∶炙甘草=8∶3∶3∶2，以該劑量作為低劑量，2倍該劑量為高劑量。用藥劑量按實驗動物與60kg成人體表面積比等效量核算比率，計算動物的等效劑量。實驗時以去純化水配制成所需濃度，放冰箱保存。

1.1.3 實驗飼料 基礎飼料及高脂飼料（北京科澳協力飼料有限公司）。

1.1.4 試劑 AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C的全自動生化分析試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；IL-6、IL-10、TNF-α酶聯免疫試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.1.5 主要儀器 7160全自動生化儀（日本日立公司），美國MULTISKAN MK3全自動酶標儀（Thermo），CH-6010組織勻漿機（KINEMATTICA）。其他設備及器具包括：手術器械、離心管、移液管、吸管、試管、燒杯等。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 以高脂飼料連續飼喂8周[9]，自由飲水、攝食，建立NASH大鼠模型。

1.2.2 分組及處置 全部SD大鼠飼喂基礎飼料1周后，隨機分為4組，每組10只，分別為空白組、模型組、葛根芩連湯低劑量組、葛根芩連湯高劑量組。空白組給予普通飼料，模型組和給藥組給予高脂飼料。給藥組在飼喂高脂詞料的同時分別給予10mL/kg鼠重相應濃度中藥灌胃；模型組和空白組按鼠重灌服純化水。每天固定時間進行一次灌胃，每個組的造模和灌胃同行進行，實施8周結束。

1.2.3 標本采集 實驗8周結束全部大鼠取材，取大鼠腹主動脈血及肝組織用于血清學和肝組織相關指標檢測。

1.2.4 血清學指標 全自動生化分析儀進行測定血清的相關指標：ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C。酶聯免疫法測定血清IL-6、IL-10、TNF-α。

1.2.5 肝組織勻漿上清指標 肝臟IL-6、IL-10、TNF-α水平。在冰水浴中，取肝組織利用超聲勻漿機制成勻漿，靜置一會，離心后取上清液，按試劑盒說明進行檢測。

1.3 統計學分析

采用SPSS19.0軟件，計量資料以（）表示，對實驗結果進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝臟酶學

在血清ALT、AST水平檢測，模型組顯著高于空白組（P<0.01），葛根芩連湯高、低劑量組顯著降低于模型組（P<0.05）。見表1。

2.2 血脂

與空白組比較，模型組血清HDL-C水平顯著降低，血清LDL-C、TG、TC含量明顯增加，差異均具有統計學意義（P<0.01）。葛根芩連湯高、低劑量組血清HDL-C水平與模型組相比增加，血清TG、TC、LDL-C水平下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 血清IL-6、IL-10、TNF-α測定

與空白組比較，模型組血清IL-10顯著降低，血清IL-6、TNF-α明顯增加，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，葛根芩連湯高、低劑量組在增加血清IL-10、降低血清IL-6、TNF-α方面差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 肝組織勻漿IL-6、IL-10、TNF-α測定

與空白組相比，模型組肝組織勻漿IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，差異均具有統計學意義（P<0.01）；葛根芩連湯高、低劑量組與模型組相比，對肝組織勻漿IL-6、IL-10、TNF-α的改善，差異均具有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

雖然現代醫學對NASH的發病機制及治療已經進行了大量研究，但由于該病發病的復雜機制及西藥作用的單一性使研究受到阻礙，而葛根芩連湯治療NASH方面鮮有報道。本實驗采用高脂飲食誘導的大鼠NASH模型[10-11]，該模型的建立符合人類NASH常見的發病因素，與人類NASH的發病機制也基本相似，能出現以胰島素抵抗、代謝綜合征等為特征的全身代謝紊亂表現，肝臟組織病變具有進行性發展的特點。根據配方的不同，多數可以在4～8周內形成病變程度逐漸加重的NASH模型[12]。現代研究發現，葛根芩連湯可用于治療2型糖尿病濕熱內蘊證，饋蕩性結腸炎等疾病[13-15]，具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。因此，本實驗遵循中醫學“異病同治”的原則[16]選用葛根芩連湯進行防治NASH的探索性研究。本實驗結果顯示，在肝細胞損害方面，造模8周后，大鼠模型血清ALT、AST水平顯著升高，葛根芩連湯同時干預的各組，血清ALT、AST水平較模型組明顯降低，提示葛根芩連湯高、低劑量組同時干預對防治NASH轉氨酶升高方面有積極作用；在血脂代謝方面，造模8周后，大鼠模型血清LDL-C、TG、TC含量顯著升高，HDL-C顯著降低，葛根芩湯同時干預的各組中，葛根芩連湯高、低劑量組血清HDL-C水平與模型組相比明顯增加，血清TG、TC、LDL-C水平明顯下降，提示葛根芩連湯基本可以達到對NASH脂代謝異常的改善作用[17-19]；在血清及肝組織炎性因子方面，造模8周后，大鼠模型血清及肝組織IL-6、TNF-α含量顯著升高，IL-10顯著降低。與模型組相比，葛根芩連湯同時干預的各組中，葛根芩連湯高、低劑量組在增加IL-10、降低IL-6、TNF-α方面均差異顯著。提示葛根芩連湯在改善炎性因子方面，不僅對NASH引起的肝臟局部炎癥有影響，同時能夠改善全身血清炎癥因子水平，并從抑制促炎因子，提高抑炎因子兩方面動態調控炎癥的發展。雖然中醫藥防治NASH的實驗研究為臨床用藥及新藥開發提供了更多的實驗數據，可以看到中醫藥多靶點調控疾病發生發展的優勢，特別是在調節脂代謝、干細胞損傷、炎癥等方面效果顯著。然而，其中仍然存在一些問題：目前實驗研究所用的動物模型雖然力求在病因、發病機制、組織病理學表現上與人類接近，但仍不能完全符合中醫傳統的證候學特點，對于中醫藥的實驗研究，仍缺乏病證結合的理想模型，極大影響了中醫藥防治NASH的研究進展。而且對于實驗研究結果缺少細致地思考與分析，普遍停留在重復性認識上，研究結果回歸臨床的價值少有體現。所以今后的研究應盡可能緊密聯系臨床實際，對研究結果進行深入地思考分析，必要時可進行重復實驗以驗證研究結果的可靠性，從而為臨床治療提供科學的實驗依據。endprint