長春地區598例乙型肝炎病毒基因分型及耐藥變異分析

劉淑榮　黃顯嬌　趙文靜等

[摘要] 目的 研究長春地區598例乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）基因分型及耐藥基因突變情況。方法 收集598例HBVDNA高于檢測下限（>1000拷貝/mL）乙型肝炎患者血清，PCR反向點雜交法檢測HBV基因型和耐藥變異位點。 結果 598例樣本中， B基因型35例（5.85%）， C基因型525例（87.79%），BC混合基因型32例（5.35%），D基因型2例（0.33%），未分型4例（0.67%）。79例發生HBV耐藥變異，總體變異率為13.21% ，其中B基因型3例（3.80%），C基因型73例（92.41%），BC混合基因型2例（2.53%），未分型1例（1.27%）； rtM204檢出率最高75.94%（60/79）， rtM204變異位點耐藥突變模式有10種類型。 結論 長春地區HBV感染患者基因型以C基因型為主，HBV基因耐藥以rtM204位點檢出率最高，變異模式復雜。

[關鍵詞]乙型肝炎；HBV基因分型；基因耐藥；PCR反向點雜交法

[中圖分類號] R446.61 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）15-12-03

[Abstract] Objective To investigate Hepatitis B virus genotype and drug-resistant mutation patterns in 598 patients with hepatitis B in Changchun region. Methods Serum of a total 598 patients with hepatitis B whose HBVDNA was higher than the lower limit of detection （more than 1000copies/mL） were collected. To detect HBV genotype and drug-resistance site mutation by PCR reverse dot blot hybridization method. Results Of the 598 serum samples， there were 35 samples（5.85%） of genotype B， 525 samples（87.79%） of genotype C， 32 samples（5.35%） of B and C mixed genotype， 2 samples（0.33%） of genotype D and 4 samples（0.67%） of undifferentiated type. Drug-resistant mutation were detected in 79 samples， accounting for 13.21%， which included 3 samples（3.80%） of genotype B， 73 samples（92.41%） of genotype C， 2 samples（2.53%） of B and C mixed genotype and 1 case（1.27%） of undifferentiated type. The most frequently detection rate of rtM204 mutation was 75.94%（60/79）. There were 10 types of patterns in rtM204 site mutation. Conclusion The main HBV genotype is genotype C in patients infected by HBV in Changchun region， and the detection rate of rtM204 site mutation is the highest among all the drug-resistance site mutations detected in patients with hepatitis B， what's more the mutation patterns are complicated.

[Key words] Hepatitis B； HBV genotype； Drug-resistance mutation； PCR combined reverse dot blot method

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的公共衛生問題，我國約有9300萬HBV感染者，其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者約2000萬例，每年約有30萬人死于HBV感染所指的肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌[1-2]。根據HBV全基因核苷酸序列的異質性將HBV分為A-H共8種基因型，HBV基因型具有明顯的地域差異，同時不同基因型與病情的嚴重程度、預后、抗病毒治療效果等方面都可能有一定的相關性[3-5]。核苷（酸）類似物[nucleos（t）ide analogue，NAs]起效迅速、服用方便、副作用小，是目前臨床治療慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要藥物，隨著NAs的長期使用HBV發生耐藥的危險性也隨之增加，HBV耐藥變異是引起NAs 抗病毒治療失敗的最重要的原因[6-10]。本研究采用PCR反向點雜交法檢測長春地區598例HBV感染患者的HBV基因型及常見的8個耐藥位點變異情況，了解本地區HBV基因型分布特征和HBV耐藥變異位點突變模式，為乙型肝炎患者抗病毒治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 血清標本

采集2013年1月～ 2014年1月吉林省肝膽病醫院門診和住院乙型肝炎患者，篩選出HBVDNA高于檢測下限（>1000拷貝/mL）患者598例，其中男448例，女150例，年齡15 ～ 76歲。病例診斷均符合2010版中國《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準[11]，排除合并甲、丙、戊和庚型肝炎病毒感染，血清標本-80℃保存備檢。

1.2 HBV感染血清學標志物和HBVDNA測定

患者血清HBV感染標志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 、HBcAb采用羅氏試劑在羅氏7100電化學發光儀測定（Roche Diagnose，中國上海）；HBVDNA采用中山達安基因有限公司試劑在美國ABI熒光定量PCR擴增儀測定。

1.3 HBV基因分型和耐藥檢測

采用深圳亞能生物技術有限公司生產HBV分型和耐藥突變基因檢測試劑盒，可檢測HBV B＼C＼D基因型以及常見核苷（酸）類似物耐藥相關的8個耐藥位點，包括：rt180、rt184、rt204、rt202、rt207、rt181、rt236、rt250。

1.4 HBV基因型和耐藥性檢測方法

嚴格按試劑盒說明書進行操作，主要操作流程如下：（1）離心柱提取方法提取血清HBVDNA；（2）DNA為模板進行HBVDNA 的PCR擴增；（3）恒溫雜交箱47℃雜交1.5h；（4）洗膜；（5）孵育；（6）顯色：將膜條浸泡與顯色液中避光顯色15min，觀察結果。

2 結果

2.1 患者基本臨床資料

598例乙型肝炎患者中，急性肝炎25例，慢性乙型肝炎313例，肝癌58例，肝硬化202例， 均為HBsAg陽性，其中HBe Ag陽性358例，HBe Ag陰性240例，HBVDNA定量檢測顯示Log10 HBVDNA（5.36±2.24）copies/mL。

2.2 HBV基因分型檢測結果

598例乙型肝炎患者HBV基因分型檢測結果：B基因型5.85%（35/598），C基因型87.79%（525/598），BC混合基因型HBV感染者占5.35%（32/528），D基因型0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598）。313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313）。

2.3 HBV耐藥變異檢測結果

在598例患者中檢出79例發生HBV耐藥變異，總體變異率為13.21%（79/598），其中B基因型3例（3.80%，3/79），C基因型73例（92.41%，73/79），BC混合基因型2例（2.53%，2/79），未分型1例（1.27%，1/79）。檢出相關耐藥突變位點有rtL180M、rtT184A/L、rtM204I/V、rtS202G、rtM/V207I、rtA181V/T、rtN236T、rtM250V/L。8個HBV相關耐藥突變位點檢出率各不相同， rtM204檢出率最高75.94%（60/79），其余位點檢出率分別為rtL180（38/79），rtA181（18/79）， rtN236（9/79）， rtT184（3/79）， rtS202（1/79）， rtM250（1/79）， rtM/V207（1/79）。

進一步分析對60例rtM204位點變異情況，rtM204位點有10種突變模式，2種rtM204單一位點變異和8種與其他耐藥位點聯合突變模式，結果見表1。

3 討論

在中國主要以B基因型和C基因型為主，其中北方以C基因型為主，南方以B基因型為主[12]。本研究采用PCR反向點雜交法檢測長春地區598乙型肝炎患者HBV基因型，檢測出B基因型5.85%（35/598）， C基因型87.79%（525/598），基因BC混合型5.35 %（32/528），0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598），其中313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313），研究結果表明長春地區HBV感染者以C基因型為主，B基因型和BC混合型較少，此研究結果符合我國北方HBV基因型地理分布特點。

目前治療CHB的核苷（酸）類藥物主要有拉米夫定（LAM），阿德福韋酯（ADV），恩替卡韋（ETV）和替比夫定（LdT），在應用NAs長期抗病毒治療過程中，耐藥是非常重要的問題，一旦發生耐藥，不僅影響抗病毒治療效果，增加后續治療的難度，甚至可導致疾病進展，增加發生肝功能失代償的風險。在抗病毒治療過程中檢測HBV耐藥位點檢測，確定HBD耐藥基因突變模式，合理選擇抗病毒藥物及確定治療方案。本研究主要對臨床常用的四種核苷（酸）類藥物相關的8種耐藥基因進行檢測。在598例乙型肝炎患者中檢出79例有HBV耐藥變異，總體變異率為13.21%（79/598），79例耐藥變異中8個位點上的耐藥變異檢出率各不相同， rtM204檢出率最高75.94%（60/79），rtM204I/V位點變異主要與LAM和LDT耐藥相關，rtM204檢出率高可能有二方面的原因，一是LAM和LDT 為低耐藥基因屏障藥物，另一方面可能與LAM在我國上市最早、使用時間最長，應用患者較多有關[13-14]。

本研究對60例發生rtM204位點變異進行了分析，結果顯示rtM204位點有10種突變模式，2種rtM204單一位點變異和8種與其它耐藥位點聯合突變模式。rtM204I/V耐藥通路與LAM和LdT耐藥及ETV耐藥進化相關[15]，僅需出現rtM204原發耐藥位點突變位點即可導致LAM和LDT耐藥，同時rtM204I/V位點變異可以促進發生ETN耐藥，在現有的可供選擇的抗病毒藥物中，一旦發生rtM204I/V變異，后續抗病毒治療的難度明顯增加。Tenney等[16]的研究表明rtM204V與rtL180M聯合變異病毒株更易發生與ETV耐藥相關rt184、rt202和rt250位點突變， 在臨床治療中對已發生rtM204V與rtL180M聯合突變的療效不佳CHB患者加用或換用ETV抗病毒治療時，必須密切注意患者的病情變化。

綜上所述，本研究通過檢測了598例HBV感染患者的HBV基因型及常見的8個耐藥位點變異情況，長春地區HBV感染患者以C基因型為主，B型和BC混合型較少，同時觀察到乙型肝炎患者HBV基因耐藥的變異類型和變異模式日趨復雜，在長期抗病毒治療過程中，進行HBV基因耐藥檢測，對于正確選擇抗病毒藥物及合理選擇治療方案具有重要的參考價值。

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（收稿日期：2015-03-12）