應用454測序技術評價非酒精性脂肪性肝病患者腸道菌群結構差異*

沈 峰，陳建能，鄭瑞丹，王曉穎，潘 勤，陳光榆，章瑞南，徐雷鳴，范建高

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確病因以外的因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床綜合征。其疾病譜包括單純性脂肪肝（Simple fatty liver，SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關肝纖維化或者肝硬化，嚴重時可進展為肝癌。隨著肥胖和代謝綜合征的全球化流行趨勢，NAFLD已成為當今發達國家和中國富裕地區慢性肝病的首要病因[1]。腸道含有人體最大的貯菌庫及內毒素池，其微生物總量達到10～100萬億，總質量約1000克，其基因組更是人體細胞基因組的150多倍[2]。早在80年前Hoefert首次描述了慢性肝病患者腸道菌群種類的改變，揭示了腸道菌群在“肝-腸循環”中所起的重要作用。腸源性物質通過門靜脈進入體內，肝臟作為門靜脈的首過器官，與腸道微生態不僅在解剖上，而且在功能上都有著密切的聯系[3]。近年來研究顯示，腸道菌群失衡在SFL、NASH及其相關纖維化或肝硬化進程中發揮著非常重要的作用。隨著高通量測序技術及人體腸道菌群宏基因組學研究的進展，肥胖相關的腸道菌群結構特征已逐漸清晰[4]，而與肥胖相關的NAFLD患者腸道菌群組成尚不明確。本研究采用454測序技術，對NAFLD患者腸道菌群結構改變的生物學特征進行了初步分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2012年7月至2012年12月在新華醫院消化內科進行“肝活檢”確診的成年（>18周歲）NAFLD患者，診斷標準符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南2010年修訂版》[5]。排除標準：過渡飲酒（折合乙醇量大于>140 g/w，女性>70 g/w）、病毒性肝炎（如慢性乙型或丙型肝炎）、藥物性肝損傷、全胃腸外營養、HIV感染、自身免疫性肝炎等疾病。同期招募健康體檢者作為正常對照組，完成受控衰減參數（Controlled attenuation parameter，CAP） 檢 查 ，以CAP<215 dB/m為依據排除肝脂肪變（超過5%）[6]。排除健康人有過渡飲酒、糖尿病、高血壓及高脂血癥等病史。所有研究對象在入組前2月內停止使用抗生素、微生態調節劑、酸奶、胃腸道動力藥物及其他可影響腸道菌群的藥物。入組當天空腹完成身高、體質量、腰圍等測量，留取肘靜脈血5 ml，置-20℃冰箱保存，備血清學測定。本研究方案經新華醫院倫理委員會備案，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 肝活檢 使用MaxCore一次性肝活檢穿刺針（18G，美國BARD生物系統公司），在B超引導下行肝活檢術。肝組織長度＞1.6 cm，每份標本的匯管區數≥6個。將肝組織條立即置于4%中性甲醛溶液中固定，采用改良法脫水、包埋、切片，分別行蘇木素-伊紅、Masson三色及網狀纖維染色，由同一名有經驗的病理科醫師閱片。參照美國國立衛生研究院關于NASH臨床研究網提供的病理工作組指南，進行NAFLD活動度積分（NAFLD activity score，NAS）和纖維化分期評定[7]。NAS包括肝脂肪變（0～3）、小葉內炎癥（0～3）及肝細胞氣球樣變性（0～2），總分為8分。NAS>4分，確診NASH；脂肪含量分為S0（<5%）、S1（5%～33%）、S2（34%～66%） 和 S3（>66%）。

1.3 糞便總DNA抽提 采集晨起新鮮糞便約1～2 g，立即置于無菌采樣盒內，-80℃低溫冷凍保存。取200 mg冰凍樣品，采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（德國QIAGEN公司）快速提取和純化DNA，在完成濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳評定后，保存于-20℃冰箱。

1.4 16S DNA V3～V5測序 采用聚合酶鏈反應和焦磷酸測序法，使用16 s V3～V5區通用引物926 F（5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’） 和 338 R （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），在 5’末端，采用Roche/454特異性接頭和（或）多重標簽（multiplex identifier，MID）修飾，其PCR產物覆蓋V3～V5可變區。配置反應體系50μL，每個反應體系包括PFX DNA 聚合酶（250U）0.8 μL，10×PFX 緩沖液（Mg2+）5 μL，dNTP 混合物（各 10 mM）2 μL、引物 6 μL（各 10 μM），DNA 模板（20 ng）1 μL 和三蒸水 35.2 μL，共50μL。采用AXYGEN磁珠法純化PCR產物，PCR反應條件為95°C預變性2 min，然后，在95°C條件下變性 20 s，50°C 退火 30 s，72°C 延伸 30 s，擴增 30個循環。使用Roche 454 GS FLX系統（深圳華大基因公司）和焦磷酸測序。

1.5 統計學處理 應用Mothur軟件（Version 1.31.2）在97%序列相似度下將非冗余的讀長（Reads）進行物種注釋，并聚類成可操作分類單元（Operation taxonomy unit，OTU），在每個OTU內51%以上reads的注釋結果為該OTU的分類[8]。應用QIIME（Version 1.50，http://qiime.org/index.html）軟件，計算樣品Alpha多樣性相應Shannon指數稀釋曲線。應用SPSS 13.0軟件對其余數據進行統計學處理，計量資料以（）表示，各組之間均數的比較采用t檢驗；計數資料用率（%）表示，各組之間的比較采用x2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般特征 本研究共納入經“肝活檢”證實的NAFLD患者47例，男性35例，女性12例；年齡（37.7±11.9）歲）。健康人34例，男性27例，女性7例；年齡（40.0±8.0）歲。兩組在性別和年齡方面無顯著性差異（P＞0.05）。NAFLD患者伴有糖尿病5例（10.6%）、高血壓6例（12.8%）。肝組織學脂肪變性診斷S1 24例（51.1%）、S2 19例（40.4%）、S3 4例（8.5%）；NASH 25例（53.2%）；輕度纖維化27例（57.4%）、中度纖維化4例（14.8%）、重度纖維化3例（6.4%）。NAFLD患者體質指數（Body mass index，BMI）、腰圍、丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯和低密度脂肪蛋白-膽固醇等顯著高于健康人（表1，P＜0.01）。

表1 非酒精性脂肪性肝病與健康人一般資料（）比較

表1 非酒精性脂肪性肝病與健康人一般資料（）比較

非酒精性脂肪性肝病（n=47）健康人（n=34） P體質指數（kg/m2） 27.6±3.1 21.7±1.7<0.001腰圍（cm） 94.8±7.3 81.9±7.1<0.001空腹血糖（mmol/L） 5.8±2.6 5.5±0.6 0.522 ALT（U/L） 45.4±28.9 17.6±6.5<0.001 AST（U/L） 30.3±19.3 19.5±6.6<0.001總膽固醇（mmol/L） 5.0±1.0 4.6±0.7 0.06甘油三酯（mmol/L） 2.1±1.4 0.9±0.7<0.001高密度脂蛋白-膽固醇（mmol/L） 1.3±0.3 1.4±0.2 0.146低密度脂蛋白膽固醇（mmol/L） 2.9±0.7 2.4±0.5 0.001

2.2 腸道菌群多樣性比較 兩組人群均完成了測序。在排除與已知序列相似度小于75%的序列后，平均每個樣本獲得3784條序列。通過序列比對及進行距離矩陣計算后，在97%（即種）水平上進行OTU劃分，提示47例 NAFLD患者OUTs為（88.3±28.3），顯著低于34例健康人（109.7±30.7）。通過Shannon指數分析群落的豐度和多樣性，結果顯示NAFLD患者腸道菌群多樣性相對于健康人顯著減少。

2.3 物種組成分析 在“門（Phylum）”的水平，NAFLD患者厚壁菌門（Firmicutes）所占比例為（51.2±17.8）%，顯著高于健康人的[（46.4±12.8）%，P=0.048]，而擬桿菌門（Bacteroidetes）在 NAFLD 組為（31.6±18.9）%，顯著低于健康人的[（43.3±14.4）%，P<0.001，圖 1]；在“綱（Class）”的水平上，NAFLD 組厚壁菌門中 Erysipelotrich i綱占（3.2±5.1）%，顯著高于健康人的[（1.0±1.2）%，P=0.009]，而擬桿菌門中 Bacteroidia綱占（31.0±18.8）%，顯著低于對照組的[（42.3±14.0）%，P=0.004，圖 2]；在“屬（Genus）”的水平上，NAFLD 組乳球菌（Lactococcus）占（0.0038±0.0001）%，低于健康組的[（0.0145±0.001）%，P=0.003，圖 3A]；NAFLD患者普氏菌屬（Prevotella）同樣也顯著減少（P=0.022，圖 3B），而鏈球菌（Streptococcus）在NAFLD占（1.50±0.03）%，顯著高于對照組[（0.21±0.24）%，P=0.004，圖 3B]。

3 討論

在SFL、NASH及相關肝纖維化或肝硬化發病中涉及腸道菌群的變化，但過去限于技術條件的限制，對于NAFLD患者腸道菌群的變化仍然知之甚少。近年來，隨著技術手段的進步，研究腸道微生物的方法已經從早期的細菌分離培養和基于16S基因的PCR-DGGE、RFLP、16S芯片和16S克隆文庫測序等，逐漸發展到16S高通量測序和宏基因組測序，從全基因組水平來分析腸道菌群的構成已成為可能。因此，對于NAFLD患者而言，從腸道菌群的總體構成以及尋找某種特殊的菌種，可以為理解NAFLD/NASH的發病以及從源頭上解決熱量過剩等提供理論支持。本研究納入47例經“肝活檢”確診的NAFLD患者和34例健康人，對新鮮糞便進行了454測序，結果發現NAFLD腸道內定植菌群發生了顯著變化。通過OTUs比較，發現NAFLD患者腸道菌群多樣性明顯減少，其菌種結構改變是NAFLD發病的誘因還是結果，還需要研究。

超重或肥胖是人類NAFLD的主要危險因素。微生物學研究通過對肥胖或消瘦人群腸道微生物結構進行對比，發現菌群比例存在一定的差異[9]。動物實驗同樣發現，小鼠腸道菌群中90%以上由擬桿菌門和厚壁菌門組成，兩者比例的改變可能影響能量的吸收。例如，與同窩出生的瘦ob/ob小鼠比，肥胖小鼠腸道中厚壁菌門菌群數量較擬桿菌門顯著增加，而對無菌小鼠灌注來自于肥胖小鼠的腸道微生物2周后，則能量吸收效率顯著加強，并且體質量也增加[10]。本研究通過OTUs比較，發現NAFLD組腸道菌群多樣性明顯減少。對系統發育分析提示，NAFLD組厚壁菌門所占比例顯著增加而擬桿菌門則顯著減少，與既往研究結果類似。進一步在綱的水平上探究該兩門中細菌的變化，結果發現與健康人比，擬桿菌門水平上的差異主要由Bacteroidia綱導致，而厚壁菌門的差異主要由Erysipelotrichi綱導致的。也有不少研究表明在2型糖

圖1 NAFLD患者與健康人（Control）腸道細菌在門（Phylum）水平的菌群差異比較（以百分比表示） NAFLD患者厚壁菌門（Firmicutes）所占比例顯著高于健康人，而擬桿菌門（Bacteroidetes）則低于健康人

圖2 NAFLD與健康人（Control）在綱（Class）水平菌群差異比較（以百分比表示） NAFLD組中Erysipelotrichi綱顯著高于健康人，而Bacteroidia綱低于健康人

圖3 NAFLD與健康人（Control）在屬（Genus）水平菌群差異比較（以百分比表示） NAFLD組乳球菌（Lactococcus）和普氏菌屬（Prevotella）比例顯著低于健康人，而鏈球菌（Streptococcus）則顯著高于對照組尿病[11]、肥胖人群[12]的腸道菌群表現出了高擬桿菌門和低厚壁菌門的現象，擬桿菌門增加可能與肝臟炎癥存在一定的相關性，但目前尚無明確的結論，需進一步研究。

一般來說，人體的腸道粘膜可作為防御外源性物質進入血液的第一道天然屏障。外源性物質在腸道中往往會受到腸道粘膜抗原和炎性因子的免疫監視，一旦逃避其免疫監視，肝臟則充當了第二道屏障的作用。慢性肝病患者常有肝功能異常，導致肝細胞膽汁排泄功能減弱，使得腸道中微生態環境發生變化，肝臟解毒能力降低，造成腸道中有毒物質的蓄積而破壞腸道粘膜屏障，這樣容易給過路菌提供接觸及吸附黏膜的機會，從而使得環境有害細菌過度的生長，腸壁局部防御能力降低，而這些因素都可以使慢性肝病患者腸道菌群失調加重。本研究在屬的水平上研究發現，NAFLD患者Lactococcus屬顯著減少。Lactococcus屬是人體腸道中的一種優勢菌，也是益生菌，其數量的減少可能會削弱宿主部分的生理功能，對宿主的健康狀態造成不良影響，而其最明顯的表現就是讓一些外源性的有害菌及條件致病菌數量增加，對腸道的免疫屏障造成損害，最終引起細菌的移位，導致體內多個臟器的嚴重細菌感染。Streptococcus屬廣泛存在于自然界及人和動物糞便或鼻咽部，為條件致病菌。該屬細菌顯著增加的可能原因是由于慢性肝病破壞了腸道的免疫屏障，使得Streptococcus屬移位至腸道，導致腸道Streptococcus屬數量的上升，從而加劇了腸道菌群的失調。

有關腸道菌群紊亂導致NAFLD發病的可能機制涉及多方面。例如，革蘭氏陰性菌產生的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 導致 Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）信號通路活化，后者可能與胰島素抵抗和NASH發病密切相關[13，14]。LPS還可導致組織膽堿含量減少，增加脂肪聚集肝臟[15]，促進內源性乙醇合成[16]和小腸細菌過度生長等有關[17]。動物實驗發現經益生菌 （例如 VSL#3、Lactobacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilus、Bifidobacterium）或益生元干預后可以改善脂肪肝動物模型肝臟脂肪含量和脂肪酸β氧化。對NAFLD患者進行益生菌干預后也可以發現血清TNF-α、IF-6、ALT、AST和IL-10等水平降低[18]。因此，通過改變腸道微生態（如補充益生菌）來調節腸道能量的吸收或減少腸源性內毒素血癥（Intestinal endotoxaemia，IETM）的產生，是 NAFLD臨床治療的新“靶點”，對于NAFLD甚至代謝性疾病的治療可能是一個很有希望的突破。當然，在臨床試驗或動物實驗中對涉及到的腸道菌群重塑后的穩定性、飲食對于腸道菌群的調控作用、抗生素對于腸道菌群的影響以及糞便移植的方法學等，都需要更多的研究來解決。

本研究還存在一些不足，如樣本量較少，尚未分析NASH或肝纖維化程度與腸道菌群失調的關聯。這些還有待于今后繼續擴大樣本量后進行相關研究，從而為豐富NAFLD的發病機制和危險因素預警等機制研究提供重要的循證醫學證據。

[1]Fan JG，Farrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China.J Hepatol，2009，50（1）:204-210.

[2]Turnbaugh PJ，Ley RE，Hamady M，et al.The human microbiome project.Nature，2007，449（7164）:804-810.

[3]沈峰，范建高.腸道菌群及宏基因組學與非酒精性脂肪性肝病研究現狀. 中華肝臟病雜志，2013，21（11）：811-814.

[4]Le CE，Nielsen T，Qin J，et al.Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers.Nature，2013，500（7464）:541-546.

[5]非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：163-166.

[6]Karlas T，Petroff D，Garnov N，et al.Non-invasive assessment of hepatic steatosis in patients with NAFLD using controlled attenuation parameter and 1H-MR spectroscopy.PLoS One，2014，9（3）:e91987.

[7]Kleiner DE，Brunt EM，Van Natta M，et al.Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology，2005，41（6）:1313-1321.

[8]Schloss PD，Westcott SL，Ryabin T，et al.Introducing mothur:open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities.Appl Environ Microbiol，2009，75（23）:7537-7541.

[9]Ley RE，Turnbaugh PJ，Klein S，et al.Microbial ecology:human gut microbes associated with obesity.Nature，2006，444（7122）:1022-1023.

[10]Turnbaugh PJ，Ley RE，Mahowald MA，et al.An obesityassociated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.Nature，2006，444（7122）:1027-1031.

[11]Larsen N，Vogensen FK，van den Berg FW，et al.Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.PLoS One，2010，5（2）:e9085.

[12]Turnbaugh PJ，Hamady M，Yatsunenko T，et al.A core gut microbiome in obese and lean twins.Nature，2009，457（7228）:480-484.

[13]Ruiz AG，Casafont F，Crespo J，et al.Lipopolysaccharide-binding protein plasma levels and liver TNF-alpha gene expression in obese patients:evidence for the potential role of endotoxin in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis.Obes Surg，2007，17（10）:1374-1380.

[14]Shanab AA，Scully P，Crosbie O，et al.Small intestinal bacterial overgrowth in nonalcoholic steatohepatitis:association with tolllike receptor 4 expression and plasma levels of interleukin 8.Dig Dis Sci，56（5）:1524-1534.

[15]Dumas ME，Barton R H，Toye A，et al.Metabolic profiling reveals a contribution of gut microbiota to fatty liver phenotype in insulin-resistant mice.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（33）:12511-12516.

[16]Cope K，Risby T，Diehl AM.Increased gastrointestinal ethanol production in obese mice:implications for fatty liver disease pathogenesis.Gastroenterology，2000，119（5）:1340-1347.

[17]Soza A，Riquelme A，Gonzalez R，et al.Increased orocecal transit time in patients with nonalcoholic fatty liver disease.Dig Dis Sci，2005，50（6）:1136-1140.

[18]Kelishadi R，Farajian S，Mirlohi M.Probiotics as a novel treatment for non-alcoholic fatty liver disease；a systematic review on the current evidences.Hepat Mon，2013，13（4）:e7233.