慢性乙型肝炎患者外周血調節性T細胞及其相關細胞因子水平檢測及臨床意義*

李彩東，陳錫蓮，田鵬飛，李惠軍，吳 斌

慢性乙型肝炎的發病機制復雜。國內外學者認為導致慢性肝損傷的主要原因是機體免疫調控紊亂。CD4+CD25+調節性T細胞（T regulatory cells，Tregs）具有免疫抑制功能，能在自身免疫性疾病、腫瘤免疫、移植免疫[1]發生發展過程中發揮重要作用[2]。Th1/Th2細胞失衡可能是HBV感染慢性化的機制之一[3]。因此，針對慢性乙型肝炎患者Th1和Th2類細胞因子的研究也是慢性乙型肝炎發病機制研究的熱點之一。Th1型細胞因子主要有白細胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）等，Th2型細胞因子有轉化生長因子 β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）等[4]。本研究旨在探討 HBV 感染者外周血 CD4+CD25+Treg及 IL-18、IFN-γ、TGF-β 水平的變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2012年7月～2012年12月我院門診和住院收治的慢性乙型肝炎（CHB）患者63例，男性30例，女性33例；年齡21～57歲，平均年齡（37.28±12.08）歲。HBV攜帶者（ASC）112例，男性69例，女性43例；年齡28～63歲，平均年齡（41.45±13.17）歲。診斷符合2010年12月中華醫學會肝病學會和感染病學會聯合修定的慢性乙型肝炎防治指南[5]的標準。所有患者均未接受過免疫調節和抗病毒治療，6個月內未接受過保肝治療。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝損傷。另選擇同期門診健康體檢者50例，男性25例，女性25例；年齡23～58歲，平均年齡（38.6±13.1）歲，排除各型肝炎病毒感染，排除心肺疾病，肝功能正常。

1.2 外周血CD4+CD25+調節性T細胞檢測 空腹取外周血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2）抗凝，在樣品測定管中加入抗凝血50μl，加入抗CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP單克隆抗體20μl（購自美國Bectond-Dickinson公司），振蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加入溶血素2 ml，振蕩混勻，室溫避光放置15 min。1500 r/m離心5 min，棄上清液。加入PBS 2 ml，1500 r/m離心5 min，棄上清液，重復一次。加入PBS 500μl，上機（FACSV Verse流式細胞分析儀，美國Becton-Dickinson公司）檢測。全部數據用流式細胞儀和BD FAC Suite軟件系統進行熒光參數獲取和分析。

1.3 血清IL-18、IFN-γ和TGF-β檢測 采用 ELISA法檢測（美國R＆D公司），使用ST-360型酶標儀（上海科華）。根據標準品不同濃度的OD450值，繪制標準曲線，求出標準方程，然后換算出每個待測標本細胞因子水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以（）表示，采用 t檢驗和 Pearson相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性HBV感染者外周血調節性T細胞及其細胞因子水平變化 見表1。

表1 3組人群外周血CD4+CD25+Treg(%)和細胞因子水平（ng/ml，）比較

表1 3組人群外周血CD4+CD25+Treg(%)和細胞因子水平（ng/ml，）比較

與健康人比，①P<0.01；②P<0.05

例數 Treg細胞 IL-18 IFN-γ TGF-β健康人 50 27.30±17.59 49.79±25.68 14.41±11.75 42.28±17.50 ASC 112 28.17±18.52 524.52±81.42 204.93±47.77 336.01±82.61 CHB 63 30.97±18.78 448.51±75.75 190.93±38.52 331.22±71.67

2.2 不同HBV感染者肝功能和HBV DNA水平比較 見表2。

表2 3組人群肝功能和HBV DNA水平（）比較

表2 3組人群肝功能和HBV DNA水平（）比較

與健康人比，①P<0.01；②P<0.05

例數 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg IU/ml）健康人 50 19.90±3.95 15.38±2.68 13.67±2.30 -ASC 112 26.29±9.18 32.18±15.42 27.82±62.07 2.81±2.85 CHB 63 269.39±38.55 210.35±30.97 65.85±92.34 5.49±1.99

2.3 不同HBV DNA載量ASC人群外周血CD4+CD25+Treg和細胞因子水平比較 見表3。

表3 不同HBV DNA載量ASC外周血CD4+CD25+Treg和細胞因子

2.4 不同HBV DNA載量CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和細胞因子水平比較 見表4。

表4 不同HBV DNA水平CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和細胞因子水平（）比較

表4 不同HBV DNA水平CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和細胞因子水平（）比較

與其他兩組比，①P<0.01；與中水平組比，②P<0.05，與低水平組比，P<0.01

HBV DNA載量例數CD4+CD25+（%）IL-18（ng/ml）IFN-γ（ng/ml）TGF-β（ng/ml）高水平 18 32.45±17.45 44.79±25.68 24.82±7.92 48.01±0.58中水平 19 30.56±18.59 40.52±17.76 23.13±8.25 44.45±0.76低水平 26 30.86±19.03 41.22±18.98 20.05±9.51 41.41±0.63

3 討論

CD4+CD25+Treg是一群起負性調節的免疫抑制性T細胞，在外周血中約占CD4+T淋巴細胞的5%～10%，在1995年由Sakaguchi et al首次發現并報道。大量研究證實，CD4+CD25+Treg細胞數量減少及其免疫功能受損與機體自身免疫性疾病的發生關系密切。目前，許多學者認為CD4+CD25+Treg可抑制HBV抗原特異性T細胞，與慢性乙型肝炎的慢性化相關[7]。細胞因子作為宿主對炎癥反應產生的重要免疫調節介質，在宿主清除病毒的免疫應答和抗腫瘤過程中發揮重要作用。細胞因子、CD4+CD25+Treg和Th1/Th2細胞失衡，都可引起免疫系統的異常，導致乙型肝炎慢性化。因此，細胞因子作為宿主對炎癥反應產生的重要免疫調節介質，在宿主清除HBV的免疫應答過程中發揮重要的作用。讓我們感興趣的是慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg及細胞因子IL-18、IFN-γ、TGF-β水平與HBV DNA載量之間是否存在聯系，我們能否通過研究兩者之間的關系，為治療乙型肝炎提供依據。

本研究結果顯示，與健康對照組比較，乙型肝炎病毒攜帶者和慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg均升高，但CHB組患者CD4+CD25+Treg顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），證實慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+Treg百分數較正常人升高。HBV特異性CD4+CD25+Treg細胞的存在可能抑制HBV特異性免疫應答，使得機體無法充分清除病毒，從而導致持續感染。我們還發現CHB患者較ASC外周血CD4+CD25+Treg升高，提示慢性HBV感染過程中宿主出現過度的免疫病理損傷和炎癥反應導致T細胞被不同程度激活，CD4+T細胞分化為CD4+CD25+Treg細胞增多，從而使CD4+CD25+Treg細胞數量增加，表明 CD4+CD25+Treg細胞參與了慢性乙型肝炎的發病過程。

CD4+CD25+Treg細胞是一種免疫抑制細胞，它的增加是否與這類患者難以清除HBV有關？本研究發現，CHB組和ASC組CD4+CD25+Treg與HBV DNA載量有關，與Stoop et al的報道相一致。病毒復制越活躍的患者體內調節性T細胞的比例越高，說明機體可能通過Treg的免疫抑制效應促進了病毒的復制，提示Treg在慢性乙型肝炎的免疫耐受中起一定的作用，CD4+CD25+Treg升高也可能是慢乙型肝炎患者難以清除乙型肝炎病毒的因素之一。

本研究共選取慢性乙型肝炎患者63例、HBV攜帶者112例和健康對照組50例，對其外周血IL-18、IFN-γ、TGF-β水平進行了檢測。結果表明，ASC組和CHB組患者外周血IL-18、IFN-γ、TGF-β水平均顯著高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。CD4+CD25+Treg能夠分泌細胞因子TGF-β，其水平升高提示CD4+CD25+Treg作為抑制性免疫細胞，通過分泌TGF-β，下調免疫功能，抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化，阻礙HBV的清除，導致乙型肝炎慢性化的發生和發展。IL-18能促進T細胞增殖產生IFN-γ，增強Th1類反應，提示Th1占優勢，機體以細胞免疫為主，細胞免疫功能受到抑制，出現Th1/Th2的失衡。

本研究結果在一定程度上提示CD4+CD25+Treg和部分細胞因子參與了乙型肝炎發病的慢性化過程，這對進一步研究其在慢性乙型肝炎患者發病機制中的作用，為以CD4+CD25+Treg和細胞因子作為治療靶點的策略提供了新的思路和方法。

[1]莊勤建，邱隆敏，姚新生，等.CD4＋CD25＋調節性T細胞與乙型肝炎病毒感染的研究進展.世界華人消化雜志，2012，20（24）:2248-2253.

[2]吳銀亞，譚善忠.CD4＋CD25＋調節性T淋巴細胞在慢性乙型肝炎發病機制中的作用. 中華傳染病雜志，2012，30（9）：563-565.

[3]孫學華，劉巧麗，李曼，等.慢性乙型肝炎患者CD4+和CD8+T細胞亞群的研究. 細胞與分子免疫學雜志，2011，27（5）：545-547.

[4]Fabrizi F，Dixit V，Martin P，et al.Meta-analysis:The impact of nutritional status on the immune response to hepatitis B virus vaccine in chronic kidney disease.Dig Dis Sci，2012，（5）:1366-1372.

[5]中華醫學會肝病學分會和感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.實用肝臟病雜志，2011，14（2）：81-89.

[6]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Shimizu J，et al.Immunologic tolerance maintained by CD25+CD4+regulatory T cells:their common role in controlling autoimmunity，tumor immunity，and transplantation tolerance.Immunol Rev，2001，182:18-32.

[7]Yang PI，Althage A，Chung J，et al.Immune effectors required for hepatitis B virus clearance.Proc Nat1 Acad Sci USA，2010，107（4）:798-802.