星點設計-響應面法優化黃柏提取工藝研究△

武婧，宋忠興，古川，劉紅波，翟思程，唐志書*

(1.陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046；3.陜西省風濕與腫瘤類中藥制劑工程技術研究中心，陜西 咸陽 712046；4.陜西興盛德藥業有限責任公司，陜西 銅川 727031)

·中藥工業·

星點設計-響應面法優化黃柏提取工藝研究△

武婧1,2,3，宋忠興1,4，古川1,2,3，劉紅波1,2,3，翟思程1,2,3，唐志書1,2,3*

(1.陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046；3.陜西省風濕與腫瘤類中藥制劑工程技術研究中心，陜西 咸陽 712046；4.陜西興盛德藥業有限責任公司，陜西 銅川 727031)

目的：利用星點設計-響應面法優化黃柏的最佳提取工藝。方法：以鹽酸小檗堿含量為評價指標，選取提取時間、液料比、提取次數3個因素進行Box-Behnken中心組合設計，通過星點設計-響應面法確定黃柏最佳提取工藝。結果：黃柏的最佳提取工藝為水煎煮提取，液料比8∶1，提取時間90 min，提取3次，鹽酸小檗堿得率為32.15 mg·g-1。結論：采用星點設計-響應面法優化黃柏提取工藝，方法簡單合理，且具有良好的預測性。

星點設計-響應面法；黃柏；工藝優化

黃柏[1]又名關黃柏、川黃柏，為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。現代藥理學研究表明，黃柏具有抗病原微生物、抗潰瘍、降壓、抗心律失常等作用[2]，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡等功能。黃柏主要有效部位為生物堿類化合物，其中鹽酸小檗堿為其主要有效成分[3]，含量高達3%以上[4]。

響應面法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的試驗設計方法，通過試驗得到一定數據，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。目前中藥的提取工藝設計多采用正交設計法，其不能利用較少的試驗數據找到因素與響應值間明確的函數關系[5]，以得到最佳的工藝因素組合。響應面優化法所獲得的信息量大，直觀、預測性好。本研究采用響應面法，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，通過試驗數據建立多元回歸方程的擬合函數模型，優化黃柏提取工藝，以期為實際的生產提取工藝提供科學參考數據。

1 儀器與材料

日立LC-7000A單泵系統液相色譜儀；旋轉蒸發儀RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)；分析天平AL-2049[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永鑫實驗儀器設備廠)；KH-400KDE型高功率數控超聲波清洗機(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

黃柏藥材購于西安盛興中藥飲片廠，經陜西中醫藥大學生藥教研室王繼濤教授鑒定為黃柏的樹皮；鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-200107)；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；磷酸、十二烷基磺酸鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃柏中鹽酸小檗堿分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)[6]；檢測波長：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品5.03 mg，置于50 mL容量瓶中，加流動相制成質量濃度為0.1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取黃柏藥材各50 g，精密稱定，精密吸取不同方法提取的黃柏提取液1 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得。

2.1.4 標準曲線的繪制 分別精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液4、6、8、10、12、15 μL，注入高效液相色譜儀中，按2.1.1項下條件測定峰面積。以鹽酸小檗堿進樣量(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=16.964X-0.47，r=0.999 4，表明鹽酸小檗堿在0.4～1.5 μg與峰面積積分值線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 同一對照品溶液重復進樣6次，測定峰面積，計算RSD為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 同一對照品溶液在放置0、2、4、8、12、24 h后，精密吸取10 μL進樣分析，測定其峰面積值，計算RSD為0.57%。表明供試品溶液24 h內基本穩定。

2.1.7 重復性試驗 在相同條件下制備6份供試品溶液，按照2.1.3項下方法制備樣品，測定鹽酸小檗堿含量，RSD為0.59%，表明本分析方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收試驗 在相同條件下制備6份供試品溶液，分別加50 μg對照品，按2.1.3項下方法制備樣品，測定鹽酸小檗堿含量，平均回收率為97.5%，RSD為0.34%，表明本方法回收率良好。

2.2 單因素考察

經查閱文獻[7-12]和預試驗，選擇對提取工藝影響較大的因素，分別對提取時間、提取次數和液料比進行單因素考察。

2.2.1 提取時間考察 稱取黃柏藥材6份，每份50 g，液料比為10∶1，分別在20、30、45、60、90、120 min提取2次，濾過，合并濾液，濃縮，定容至250 mL。按2.1.1項下條件測定黃柏提取液中鹽酸小檗堿含量。結果表明，在20～120 min內，提取液中鹽酸小檗堿含量隨提取時間的增加而增加，但在90～120 min含量增加程度不明顯，故選擇90 min為最佳提取時間。

2.2.2 料液比考察 稱取黃柏藥材6份，每份50 g，液料比分別為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1，提取時間為90 min，提取2次，濾過，合并濾液，濃縮，定容至250 mL，按2.1.1項下條件測定鹽酸小檗堿含量。結果表明，提取液中鹽酸小檗堿的含量隨料液比的增大而增大，但當液料比大于8∶1時，提取液中鹽酸小檗堿含量的增幅較小，而且液料比過大，溶劑用量和濃縮工藝的能耗都會增大，因此選擇8∶1為最佳液料比。

2.2.3 提取次數考察 取黃柏藥材3份，每份50 g，液料比為8∶1，提取時間為90 min，提取次數分別為1、2、3次，濾過，合并濾液，濃縮，定容至250 mL，按2.1.1項下條件測定鹽酸小檗堿含量。結果表明，提取液中鹽酸小檗堿含量隨提取次數的增加而增加。經統計學分析，提取2次與3次所得的提取液中鹽酸小檗堿的含量差異無統計學意義，故選擇提取2次為最佳提取次數。

2.3 星點設計-響應面優化與試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以顯著影響黃柏提取效果的3個因素：提取時間、液料比、提取次數為自變量(分別以A、B、C表示)，作變換如下：A=(t-90)/30，B=(z-8)/2，C=(T-2)/1(t、z、T分別為試驗提取時間、液料比及提取次數)，以鹽酸小檗堿得率(Y)為響應值，設計3因素3水平共17個試驗點的響應面分析試驗，試驗以隨機次序進行。響應面分析因素與水平設計見表1，其中編號為13～17的試驗為5次重復的中心點試驗，用來考察模型的誤差。試驗設計與結果見表2。

表1 星點設計因素水平編碼表

表2 響應面試驗設計與結果

用ANOVA分析響應面的回歸參數。由表3可知，一次項A

表3 方差分析表

注：***差異極顯著(P<0.000 1)；**差異高度顯著(P<0.001)；*差異顯著(P<0.05)。

從表3的方差分析結果可知，試驗中選用的模型P<0.000 1，說明模型達到極顯著水平，失擬項F值為0.153 9，影響不顯著，說明該回歸方程對試驗擬合情況很好，能較好地起到預測作用，在所選試驗條件下，各因素對鹽酸小檗堿得率的影響顯著(r=0.999 7)。此外，該模型的變異系數(CV=4.78%)<5%，在可接受范圍內。

2.4 提取工藝的響應面分析與優化

采用Design-Expert軟件[13]，根據二次回歸方程繪制相應的等高線圖和自變量對因變量的三維曲面圖，分別將其中一個因素固定在中心值，以綜合評分(Y)對另外兩個因素描繪三維圖。各因素交互作用的等高線圖和響應面圖見圖1～2。對回歸方程取一階偏導數等于零，整理可得如下公式：

2.73-1.48B-0.4C-23.02A=0

公式(1)

0.24-1.48A+0.68C-15.58B=0

公式(2)

1.28-0.4A+0.68B-1.16C=0

公式(3)

聯立方程組，解得A=0.096 088，B=0.052 445，C=1.057 8，代入前述的變換公式得到提取時間t=92.882 64，液料比z=8.104 89，提取次數T=3.057 8，即黃柏的最佳提取工藝條件：提取時間為92.882 64 min、液料比為8.104 89∶1、提取次數為3.057 8。但考慮到實際情況最佳提取工藝條件修正如下：提取時間為90 min，提取次數為3次，液料比為8∶1，在此工藝條件下黃柏提取液中鹽酸小檗堿得率為31.7 mg·g-1。

圖1 兩兩交互作用對鹽酸小檗堿得率影響的等高線

圖2 兩兩交互作用對鹽酸小檗堿得率影響的響應面圖

2.5 工藝驗證試驗

按照2.4項下的最佳工藝進行驗證試驗(n=3)，黃柏提取液中鹽酸小檗堿的實際平均質量分數為32.15 mg·g-1(預測值為31.70 mg·g-1)，RSD為0.2%。試驗值與理論值偏差較小，說明本試驗中利用星點設計-響應面法優化得到數學模型可靠，具有良好的預測性，所得的工藝參數準確可信，具有較強的應用價值。

3 討論

本試驗通過用星點設計-響應面法優化黃柏的提取工藝，建立了影響因素與有效成分提取率間的數學模型方程，最終確定了黃柏的最佳提取工藝：提取時間為90 min，提取次數為3次，液料比為8∶1。最佳工藝下鹽酸小檗堿的得率為32.15 mg·g-1，與預測值(31.70 mg·g-1)的RSD為0.2%，說明該數學模型方程與實際情況擬合很好，具有良好的預測性。因此用星點設計-響應面法優化黃柏的提取工藝是可靠的，且合理可行。

[1] 中國科學院植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1997.

[2] 王浴生，鄧文龍，薛春生.中藥藥理與應用[M].北京：人民衛生出版社，1998：1024-1026.

[3] 王本祥.現代中藥藥理學[M].北京：人民衛生出版社，2000：310-311.

[4] 蔣國良，吳珂.黃柏提取工藝的優化[J].醫藥導報，2007，26(7)：792-793.

[5] 欒軍.現代試驗設計優化方法[M].上海：上海交通大學出版社，1995：191.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：286.

[7] 龍鳳來，唐柳，余鴿，等.黃柏提取工藝研究[J].楊凌職業技術學院學報，2009，8(2)：6-8.

[8] 王景媛，王昌利，史亞軍.星點設計-效應面法優化復方龍脈寧滴丸提取工藝[J].中南藥學，2013，11(3)：743-747.

[9] 白曼，馬麗娜，張小飛，等.星點設計-響應面分析法優選穿山龍總皂苷提取工藝[J].中南藥學，2013，11(1)：4-7.

[10] 陳衛衛，徐冬英，鄧超澄，等.星點設計-效應面法優選胃寧分散片的提取工藝[J].中成藥，2009，31(1)：39-43.

[11] 王秋紅，蘇陽，吳倫，等.星點設計-效應面法優化升麻提取工藝[J].中國實驗方劑學志，2012，18(1)：24-27.

[12] 毛祖林，李曉波，龔文明，等.人參皂苷提取工藝優選[J].時珍國醫國藥，2008，19(11)：2762-2763.

[13] 謝蓉，郭東艷，宋忠興，等.Box-Behnken效應面法優化淫羊藿配方顆粒提取工藝[J].現代中醫藥，2012，32(5)：71-75.

Optimization of Extraction Process of Cortex Phellodendri Chinensis by Central Composite Design-response Surface Methodology

WU Jing1,2,3，SONG Zhongxing1,4，GU Chuan1,2,3，LIU Hongbo1,2,3，ZHAI Sicheng1,2,3，TANG Zhishu1,2,3*

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，Shaanxi，Xianyang712046，China；2.ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Shaanxi，Xianyang712046，China；3.ShaanxirheumatismandtumorcenterofTCMengineeringtechnologyresearch，Shaanxi，Xianyang712046，China；4.ShaanxiXingshengdePharmaceuticalCo.，Ltd.，Shaanxi，Tongchuan727031，China)

Objective：To optimize extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis by central composite design-response surface methodology.Methods：Water was chose as the extraction solvent and the effect of three factors such as solvent-solid ratio，extraction time and times was designed by Box-Behnken central composite，taking the content of berberine hydrochloride as evaluation indicator.Extraction process was optimized by central composite design-response surface methodology.Results：The optimizing extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis were as follows：ratio of liquid to solid was 8：1，extraction repeated 3 times，90 minutes every time.The yield of berberine hydrochloride under this condition was 32.15 mg·g-1.Conclusion：Optimizing extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis by central composite design-response surface methodology is reasonable，simple，and has good predictability.

Central composite design-response surface methodology；Cortex Phellodendri Chinensis；process optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.016

國家自然科學基金資助項目(81373978)；陜西省重點科技創新團隊資助項目(2012KCT-20)

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唐志書，教授，研究方向：中藥高新制備技術應用、中藥資源開發與綜合利用研究；Tel：(029)38180560，E-mail：tzs6565@163.com