響應曲面法優化新疆阿魏種子總倍半萜香豆素提取工藝△

李廣志，王鈞篪，李曉瑾，曹麗，呂娜，沈連剛，朱軍，陳剛，斯建勇*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

·中藥工業·

響應曲面法優化新疆阿魏種子總倍半萜香豆素提取工藝△

李廣志，王鈞篪1，李曉瑾2，曹麗1，呂娜1，沈連剛1，朱軍2，陳剛2，斯建勇1*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：優化新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素的提取工藝。方法：以乙醇體積分數、料液比、提取時間為自變量，在單因素試驗的基礎上，應用Box-Behnken 中心組合設計建立數學模型，以總倍半萜香豆素提取率為響應值，進行響應面分析。結果：最佳提取工藝條件為80%乙醇加熱回流提取40 min，料液比為1∶40。總倍半萜香豆素提取率預測值為6.60%，實際值為6.62%，相對誤差為0.3%。結論：該優選工藝穩定可靠，為新疆阿魏資源的合理利用提供參考。

新疆阿魏；總倍半萜香豆素；響應曲面分析法

新疆阿魏為傘形科阿魏屬植物，主要分布在我國新疆烏魯木齊地區。倍半萜香豆素為阿魏屬植物特征類型化合物，在新疆阿魏的化學成分研究中也發現了多種倍半萜香豆素化合物。現代藥理學研究發現，該類型化合物具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、艾滋病病毒(HIV)抑制作用等多種生物活性[1-2]。目前有關總倍半萜香豆素提取工藝的研究還未見報道。本試驗在探討了各因素對提取率影響的基礎上，通過響應曲面分析法對新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素的提取工藝進行研究，優選出易操作、高得率、低成本的工藝技術，為倍半萜香豆素類化合物的研究開發提供試驗數據。

1 儀器與材料

1.1儀器

UV-2102型紫外-可見分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)；NewClassic電子天平(梅特勒-托利多上海儀器有限公司)。

1.2材料

所用藥材于2014年7月采自新疆伊犁，經新疆中藥民族藥研究所李曉瑾研究員鑒定為新疆阿魏FerulasinkiangensisK.M.Shen的種子，標本存放于新疆中藥民族藥研究所。Lehmannolone 對照品為本課題組分離純化，經核磁數據進行結構鑒定。試驗中用到的試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1供試品溶液的制備

精密稱取干燥的新疆阿魏種子粗粉1.0g，置250mL圓底燒瓶中，加80%乙醇40mL，回流提取40min，趁熱減壓抽濾，合并濾液，用提取液定容至100mL，充分搖勻后取1mL溶液，置50mL容量瓶定容至刻度，即得。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取Lehmannolone對照品11mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲加熱，使其全部溶解。放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻即得。

2.3檢測波長的確定

以甲醇為空白液，對對照品溶液進行全波長掃描，掃描結果與文獻報道[3]結果一致，在323nm處該類化合物有最大特征吸收。故本試驗選此波長為該類化合物的檢測波長。

2.4繪制標準曲線

精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mLLehmannolone對照品溶液，分別置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。搖勻后分別移取不同體積的溶液至5mL容量瓶，甲醇定容。充分搖勻后，以甲醇為空白對照，于323nm處測定吸光度(A)。以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標，得回歸方程Y=0.0428X-0.0042(r=0.9991)，表明Lehmannolone質量濃度在8.8～44mg·L-1與吸光度線性關系良好。

2.5樣品測定

精密量取適量供試品溶液，以相應的提取液為空白對照，按2.3項下方法測定A，計算總倍半萜香豆素含量。

新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取率=種子中總倍半萜香豆素提取質量/種子干重×100%=[(A+0.004 2)×5000/0.042 8]×100%

2.6單因素試驗考察

2.6.1乙醇體積分數考察 精密稱取新疆阿魏干燥種子1.0g，按2.1項下方法進行提取，按2.5項下方法進行測定。其他條件固定不變，乙醇體積分數分別為70%、75%、80%、85%、90%、100%，結果總倍半萜香豆素的提取率依次為5.27%、7.19%、7.72%、7.53%、4.78%、3.13%，因此乙醇體積分數以80%為宜。

2.6.2 料液比考察 精密稱取新疆阿魏干燥種子1.0g，按2.1項下方法進行提取，按2.5項下方法進行測定。其他條件固定不變，分別加10、20、30、40、50倍量80%乙醇，結果總倍半萜香豆素的提取率依次為5.01%、7.20%、8.31%、6.80%、6.10%，故選擇加30倍量80%乙醇。

2.6.3 提取時間考察 精密稱取新疆阿魏干燥種子1.0g，其他條件固定不變，分別按2.1項下方法提取20、30、40、50、60min，按2.5項下方法進行測定，結果總倍半萜香豆素的提取率依次為6.30%、6.32%、6.33%、6.86%、6.48%，故選擇提取50min。

2.7響應曲面分析法優化工藝

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理[4-5]，選擇乙醇體積分數(A)、料液比(B)和提取時間(C)為考察因素，在單因素試驗基礎上，采用3因素3水平的響應面分析法。見表1。選用Design-Expert8.0.6試驗設計，以總黃酮提取率為響應值進行響應面分析。試驗安排及結果見表2。

表1 新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取工藝響應面試驗因素水平表

表2 新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素的提取工藝Box-Behnken中心組合試驗安排

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得出回歸方程中的各項系數，見表3。用F檢驗檢驗顯著性[6-7]。

表3 回歸方程系數及顯著性檢驗

由表3可知，各因素對新疆阿魏種子總倍半萜香豆素的提取工藝影響順序：乙醇體積分數>料液比>提取時間。A、A2、B2、AB、BC的F檢驗均很顯著，說明各個試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而存在交互作用的二次關系。得出總倍半萜香豆素提取率的回歸方程：Y=6.77-0.71A+0.039B+0.016C-0.18AB+0.06AC-0.13BC-1.68A2-0.24B2-0.074C2。響應面回歸方程的F檢驗均很顯著；模型的校正決定系數(Adj R-Squared)=0.992 9，說明該模型幾乎可以解釋全部響應值變化；失擬項的F=18.42，P=0.183>0.05，差異不具有統計學意義，表明可用二次回歸方程模型代替試驗點對試驗數據進行分析，見圖1～3。

由圖1可知，總倍半萜香豆素的提取率隨著乙醇體積分數和料液比的增加先增大后變小。圖2表明，隨著乙醇體積分數和提取時間的增加，總倍半萜香豆素提取率先增加后下降。圖3表明，提取時間和料液比對總倍半萜香豆素提取率的影響不顯著。綜上所述，新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素最佳提取工藝條件：80%乙醇，料液比為1∶40，提取時間為40 min，此條件下總倍半萜香豆素的提取率為6.60%。

2.8精密度試驗

精密量取Lehmannolone對照品溶液2mL，共6份，分別置于10mL容量瓶中，按2.5方法進行，RSD為0.98%，說明該方法精密度良好。

2.9驗證試驗

按最佳提取條件進行6次重復試驗進行驗證，計算總倍半萜香豆素提取率分別為6.67%、6.65%、6.54%、6.57%、6.59%、6.69%，RSD為0.92%，說明該提取工藝穩定可行。

2.10準確度試驗

在已知含量的6份新疆阿魏種子總倍半萜香豆素提取液中各加入Lehmannolone對照品溶液2mL(0.22g·L-1)，按2.5方法進行測定，計算得平均回收率為100.09%，RSD為1.13%，表明該方法測定總倍半萜香豆素含量是可行的。

圖1 乙醇體積分數與料液比對新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取的影響等高線及響應面

圖2 乙醇體積分數與提取時間對新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取的影響等高線及影響

圖3 料液比與提取時間對新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取的影響等高線及響應面

2.11穩定性試驗

稱取新疆阿魏種子1.0g，按2.1方法處理。對提取液分別在0.5、1、3、6、12、24h后按2.5方法進行測定。結果顯示吸光度在24h內無明顯變化，RSD為1.25%，表明新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素成分在24h內穩定性良好。

3 討論

通過前期對新疆阿魏種子化學成分的系統研究，發現半萜香豆素類成分為其主要的特征化合物。本試驗對新疆阿魏種子總倍半萜香豆素的提取工藝進行優選，為深入開發新疆阿魏總倍半萜香豆素提取物奠定基礎。目前工藝優選常采用正交設計，但存在精度不夠，建立的數學模型預測性較差等缺陷。本試驗根據Box-Behnken中心組合設計[8]，以新疆阿魏種子為原料，建立了乙醇體積分數、料液比、提取時間對新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取率的回歸模型，并對模型進行失擬以及F檢驗和t檢驗。結果表明，可用二次回歸方程模型代替試驗點對試驗結果進行分析。

[1] 王月娥，斯建勇，李曉瑾，等.新疆阿魏種子化學成分的研究(I)[J].中國現代中藥，2011，13(1)：26.

[2] Guangzhi Li，Xiaojin Li，Li Cao，et al.Steroidal esters fromFerulasinkiangensis[J].Fitoterapia，2014，97：247.

[3] Mohamed H，Abd EI-Razek，Shinji Ohta，et al.Sesquiterpene coumarins from the roots of Ferula assa-foetida [J].Phytochemistry，2001，58：1289.

[4] 周向軍，高義霞，張霞.響應面法優化黃花菜總黃酮提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(16)：29.

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[6] 袁志發，周靜芋.試驗設計與分析 [M].北京：高等教育出版社，2000.

[7] 徐中儒.回歸分析與試驗設計 [M].北京：中國農業出版社，1998.

[8] 陳詩強，林江蕭，陳劍鋒.相應曲面分析法優化油茶籽中總黃酮提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(8)：26.

OptimizaionofExtractionTechnologyofTotalSesquiterpeneCoumarinsfromSeedsofFerulasinkiangensisbyResponseSurfaceMethod

LIGuangzhi1，WANGJunchi1，LIXiaojin2，CAOLi1，LYUNa1，SHENLiangang1，ZHUJun2，CHENGang2，SIJianyong1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthicalMateriaMedica，Urumqi830002，China)

Objective：To optimize extraction technology of total sesquiterpene coumarins from the seeds ofFerulasinkiangensis.Method：With ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time as independent variables，and on the basis of single-factor tests，Box-Behnken central composite design was used to establish mathematical method，the yield of total sesquiterpene coumarins was used as response value，response surface methodology was adopted to the analysis of response surface method.Result：Optimum extraction technology conditions were as follows：ethanol concentration 80%，solid-liquid ratio of 1∶40，extraction time 40 min.The predicted extraction yield of total sesquiterpene coumarins was 6.60%，and the verification 6.62%，with relative error of 0.3%.Conclusion：This optimized technology was reliable and stable，and it could provide reference for rational utilization of resources ofFerulasinkiangensis.

Ferulasinkiangensis；total sesquiterpene coumarins；Response Surface Methodology

國家自然科學基金面上項目(81460661，81460586)；國家“重大新藥創制”科技重大專項(2012ZX09301-002-001，2011ZX09307-002-01)

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斯建勇，研究員，研究方向：天然藥物化學；Tel：(010)57833299，Email：jianyongsi@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.021

2015-04-25)