馬黛茶中綠原酸水提取工藝研究△

臧曉韻，趙琪，胡海峰*

(1.上海農業科學院，上海 201106；2.中國醫藥工業研究總院 上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200040)

·中藥工業·

馬黛茶中綠原酸水提取工藝研究△

臧曉韻1，趙琪2，胡海峰2*

(1.上海農業科學院，上海 201106；2.中國醫藥工業研究總院 上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200040)

目的：建立馬黛茶中綠原酸水提取優化工藝。方法：以加壓毛細管電色譜(pCEC)法測定馬黛茶水提樣品中綠原酸含量，通過浸提時間、浸提水溫、茶水比3因素3水平設計正交試驗確定最佳工藝。結果：馬黛茶的最優水提取工藝：浸提溫度75 ℃；料液比1∶35；浸提時間15 min。在優化的提取工藝條件下，馬黛茶中綠原酸平均質量分數為(4.99±1.36) mg·g-1。結論：水提馬黛茶綠原酸的方法簡便可行，可用于馬黛茶原料中綠原酸的含量檢測，有利于馬黛茶的科學泡茶并提高其營養價值。

馬黛茶；水提工藝；綠原酸；加壓毛細管電色譜法；定量分析

ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040)

馬黛茶，又名巴拉圭茶(Ilex paraguariensis)，屬冬青科冬青屬，原產于南美，由南美洲獨有的馬黛樹葉精制而成，與咖啡、茶(紅茶和綠茶)并稱“世界三大茶”[1-2]。其具有較強的抗氧化、抗癌、保護心腦血管、減肥、消炎和免疫調節等活性[3]。中華人民共和國衛生部公告(2004年第6號)也已將巴拉圭茶凈油或提取物列入食品用香料名單。成品的馬黛茶呈翠綠或淺翠綠的碎末狀，香氣獨特，味有點苦澀。目前，有商家將馬黛茶以草莓、蘋果、檸檬、橙子等不同的水果味呈現，來滿足不同消費者的口味。還有各種以馬黛茶為主要成分的藥茶，如改善睡眠的、鎮痛的、止瀉的。

馬黛茶是一種純天然的飲品，與中國傳統的綠茶、紅茶有著顯著性差異：馬黛茶的主要藥理活性成分為綠原酸類物質，卻不含兒茶素類物質；另外，研究發現[2，4]，馬黛茶多酚的含量、抗氧化性能均比綠茶高，其沖泡方法也決定了多酚的攝入量。目前，關于馬黛茶的提取，國內外相關研究報道較少，而且分析方法也主要借助于高效液相分析，出峰時間較晚，樣品和試劑量消耗較大。本文選用本課題組建立的一種高效、低耗、準確的馬黛茶綠原酸的加壓毛細管電色譜(pCEC)分析方法，首次對馬黛茶的水提取工藝進行研究，旨在為開發馬黛茶的功能提供參考。

1 儀器與方法

1.1 儀器與試藥

TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜儀(上海通微分析技術有限公司)，包括2臺高壓輸液模塊，微流控模塊，可變波長紫外檢測器(190～800 nm)，高壓電源模塊(±30 kV)；KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；實驗pH計(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)。

綠原酸對照品(上海遠慕生物科技有限公司，批號：131101)，純度≥98%；馬黛茶(巴西原裝伯隆馬黛茶1000克，上海伯隆食品有限公司)；乙腈(上海人民化工廠)色譜純；水為娃哈哈純凈水；磷酸、氨水(上海試劑一廠)分析純；其他試劑(上海國藥集團)均為分析純。

1.2.1 色譜條件 毛細管填充柱(蘇州環球色譜責任有限公司，EP-100-20/45-3-C18內徑100 μm，毛細管全長45 cm，有效長度20 cm，ODS填料粒徑3 μm)；流動相A為10%甲醇+磷酸(pH2.5，2 mM)，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min 5%B、1～15 min 5%B～9%B、15～20 min 9%B～20%B、20～40 min 20%B；檢測波長為325 nm；流速為0.07 mL·min-1；電壓為-10 KV。

1.2.2 供試品溶液的制備 將馬黛茶低溫干燥后，粉碎成粗粉(過60目篩)，稱取干燥的馬黛茶粉末1 g，加入35 mL水，置于75 ℃的水浴鍋中浸提15 min，抽濾，用水定容于50 mL容量瓶，經0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

1.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品4.0 mg，加入流動相甲醇-乙腈-磷酸(2∶5∶18)定容于5 mL容量瓶中，制成對照品儲備液。使用時根據需要用流動相稀釋至相應的濃度。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限 將對照品儲備液分別進行梯度稀釋，制成一系列梯度，質量濃度分別為0.048、0.100、0.200、0.400、0.800 mg·mL-1的對照溶液，按最優色譜條件進行測定。以綠原酸對照樣品的質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為Y=284 094X+2 688.3，r=0.999 4，表明綠原酸在0.048～0.800 mg·mL-1線性關系良好。檢出限和定量限分別為5、 15 μg·mL-1。

1.2.4.2 精密度 取對照品儲備液125 μL，定容于1 mL容量瓶。重復進樣6次，記錄峰面積，得到綠原酸的RSD為1.70%，表明儀器精密度良好。

1.2.4.3 重復性 取同一批的供試品溶液6份，在最優條件下進樣分析，記錄峰面積，得到綠原酸的RSD為1.68%，表明其重復性良好。

1.2.4.4 穩定性 取供試品，分別于0、4、8、12 h進樣測定，考察其穩定性，得到綠原酸的RSD為1.66%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

按下按鍵時，通常都會有抖動，表面上看來是按按鍵一次，但是因為按鍵的抖動，單片機會判斷出按按鍵很多次，從而輸入不可控。此問題可以用“軟件消抖”來解決。當第一次檢測到按鍵按下時，不采取動作，延時一段時間后，按鍵按下信號依然存在，則認為按鍵被按下，再執行相應的動作。

1.2.4.5 回收率 吸取對照品溶液各40、50、60 μL，加入供試品溶液，定容于1 mL容量瓶中，共3份，制備低、中、高濃度的供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積。綠原酸的回收率如表1所示。

表1 馬黛茶中綠原酸的回收率

2.1 提取時間對綠原酸含量的影響

稱取1 g馬黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10加入10 mL的80 ℃水，置于80 ℃的水浴鍋中分別保溫5、15、25、45 min，過濾后定容至50 mL，測定平行樣，記錄峰面積，計算綠原酸的質量分數。結果表明，在0～15 min內，綠原酸的含量隨著時間的增加而增加；在15 min時，綠原酸的含量達到最大；在15～25 min內，綠原酸含量隨著時間的增加而減少；25～45 min內，綠原酸含量略有增加。見圖1。因此，選擇15 min提取時間作為后續的優化條件。

圖1 提取時間對綠原酸提取量的影響

2.2 提取溫度對綠原酸量的影響

稱取1 g馬黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10分別加入10 mL的60、70、80、100 ℃水，置于對應溫度的水浴鍋中保溫15 min，過濾后定容至50 mL，測定平行樣，記錄峰面積，計算綠原酸的質量分數。結果表明，在80 ℃時，綠原酸的含量達到最大。見圖2。因此，選擇水提溫度80 ℃作為后續的優化條件。

圖2 提取溫度比對綠原酸提取量的影響

2.3 料液比對提取綠原酸的影響

稱取1 g馬黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10、1∶30、1∶40、1∶50分別加入10、30、40、50 mL的80 ℃水，置于對應溫度的水浴鍋中保溫15 min，過濾后定容至50 mL，測定平行樣，記錄峰面積，計算綠原酸的質量分數。結果表明，在料液比1∶30時，綠原酸的含量達到最大。見圖3。因此，選擇1∶30作為最優料液比。

圖3 提取料液比對綠原酸提取量的影響

2.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，確定料液比、提取時間和提取溫度3個因素，進行正交試驗，因素水平表見表2，結果見表3、表4。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗結果

表4 方差分析結果

由表3的極差分析結果可知，對綠原酸提取影響程度最大的是溫度，其次是時間，最后是料液比。且由表4深入分析可知，溫度(A)和時間(C)的影響極其顯著，微小的變化即引起指標的顯著變化，料液比(B)的影響非常顯著。根據表3中K值比較，得出理論上最佳提取工藝條件為A1B3C2，而正交試驗中此方案不存在，故以此條件進行分析，得出綠原酸的質量分數為4.982 mg·g-1，大于正交試驗方案A1B2C2，確定最佳水提工藝為浸提溫度為75 ℃，料液比為1∶35，水浴15 min。

2.5 馬黛茶水提工藝穩定性及其綠原酸的含量測定

在2.4所確定的最佳工藝條件下，取5份干燥茶葉各1 g于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶35加入35 mL的75 ℃水，置于75 ℃的水浴鍋中保溫15 min，過濾后定容至50 mL，依法測定馬黛茶中的綠原酸含量。結果見表5、圖4。

表5 最佳水提工藝穩定性試驗結果

注：A.對照品；B.供試品。圖4 綠原酸對照品 試驗結果

由表5可知，按照最佳沖泡工藝條件，馬黛茶中綠原酸的質量分數為(4.999±1.361) mg·g-1。

3 討論

馬黛茶是阿根廷的“國寶”、“國茶”，現已被公認為目前世界上已知的營養保健及藥用功效全面的單科植物健康飲品。其含有豐富的活性成分，具有抗氧化、抗癌、減肥、抗心腦血管疾病等藥理作用，已經引起各國學者的關注。由于中國引進馬黛茶較晚，人們對于其日常飲用知之甚少，本文從日常沖泡的角度出發進行研究，貼近生活，更有利于馬黛茶保健作用的開發。

pCEC是一種新興的微分離技術，它結合了電泳的高效性和高效液相色譜的保留機制，與傳統的分析手段相比，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、試劑和樣品消耗少等突出優點[5]，近幾年開始也用于中藥活性成分分析[6]，并顯現出了極大的潛力。本課題組通過優化流動相和分離電壓等一系列條件，建立了一種高效、低耗、準確的分析方法，并成功應用于馬黛茶的水提工藝優化，顯示出了pCEC在提取馬黛茶中綠原酸的分析方面的巨大優勢，具有一定的應用價值。

另外，本試驗還以新綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C為指標，設計了同樣的正交試驗，結果表明，溫度、時間、料液比對以上化合物的提取無明顯影響(數據待報道)，而綠原酸在馬黛茶沖泡過程中受溫度、時間、料液比的影響較大，猜測可能是由于綠原酸分子結構中含有酯鍵、不飽和鍵及多元酚而不穩定，受溫度變化而發生水解和氧化反應[7]，故選擇綠原酸為指標進行沖泡工藝的研究。本試驗為馬黛茶的日常飲用提供有力的理論依據，也將促進馬黛茶豐富的活性成分及藥理功能為我國人民所用。

[1] Márquez V，Martínez N，Guerra M，et al.Characterization of aroma-impact compounds in yer-ba mate(Ilex paraguariensis)using GC-olfactometry and GC-MS [J].Food Research International，2013，53(2)：808-815.

[2] 吳俊玲，高紅莉，劉昭純.馬黛茶及有效成分研究概況[J].山東中醫雜志，2010，29(9)：650-652.

[3] Bracesco N，Sanchez A G，Contreras V，et al.Recent advances on Ilex paraguariensis research：Min-Ireview[J].J Ethnopharmacol，2011，136(3)：378-384.

[4] 熊建華.巴拉圭茶多酚的分離純化及功能研究[D].長沙：湖南農業大學，2007.

[5] Lu L，Chen Y，Yu X，et al.Pressurized CEC with amperometric detection using mixed-mode monolithic column for rapid analysis of chlorophenols and phenol[J].ELECTROPHORESIS，2013，34：2049-2057.

[6] 羅朵生，郭姣，周修騰.毛細管電色譜法在藥物分析中的應用[J].遼寧中醫藥大學學報，2013，15(3)：89-91.

[7] 林立洋，賀英菊，羅巍偉，等.增強綠原酸水溶液穩定性的研究方法[J].華西藥學雜志，2005，20(3)：225-228.

StudiesonWaterExtractionTechnologyofChlorogenicacidsfromMateTea(Ilexparaguariensis)

ZANGXiaoyun1，ZHAOQi2，HUHaifeng2*

(1.ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai201106；2.StateKeyLab.ofNewDrugandPharmaceuticalProcess，ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry，

Objective：To improve water extraction technology of chlorogenic acid from Mate Tea(Ilexparaguariensis).Methods：Using pressurized capillary electrochromatogaphy，the amount of chlorogenic acids in water extraction solution was determined and the extraction process was improved through 3 factors(extraction time，temperature and ratio of tea and water)and 3 levels orthogonal design.Results：The results indicated that the optimal extraction process was as follows：extraction temperature 75 ℃，ratio of material to liquid 1∶35 and extraction time 15 min.The average content of chlorogenic acids in Mate Tea(I.paraguariensis)was 4.99±1.36 mg·g-1under this condition.Conclusion：It is feasible and simple to extract chlorogenic acid from Mate Tea by means of water extracting technology for measuring chlorogenic acid and providing the method for daily drinking-tea.

Mate tea；water extraction technology；chlorogenic acid；pressurized capillary electrochromatogaphy；quantification

2014-07-14)

國家重大科學儀器設備開發專項(2011YQ15007208)；國家重大專項(2014zx09201001-012)；“十二五”大平臺子課題(X-2-3)和上海市科技支撐項目(12431901102)

*

胡海峰，男，博士生導師，研究員，研究方向：微生物分類、微生物生理與代謝、微生物藥學開發；Tel：(021)62892873，E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.012