仁栝樓一步成苗離體快繁技術△

榮俊明，韓琳娜，郭慶梅

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

·中藥農業·

仁栝樓一步成苗離體快繁技術△

榮俊明，韓琳娜*，郭慶梅*

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

目的：為解決仁栝樓種苗的大量需求及繁育繁瑣問題。方法：利用仁栝樓的腋芽作為外植體，進行一步成苗離體培養。結果：篩選出最佳一步成苗培養基為 MS+0.1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，植株再生頻率達 5.4。壯苗后的仁栝樓組織培養苗可直接移栽到育苗基質中，成活率可達77.1%。結論：仁栝樓一步成苗離體培養技術大大縮短了育苗周期。

仁栝樓；組織培養；一步成苗

栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim，為葫蘆科多年生草質藤本植物，其根(中藥名天花粉)、種子(中藥名栝樓仁)、果實(中藥名栝樓實)、果皮(中藥名栝樓皮)均可入藥，有潤肺祛痰、滑腸散結的功能[1-2]。特別是天花粉目前已被用于引產，治療葡萄胎、惡性葡萄胎和宮外孕[3]。仁栝樓是山東栽培栝樓的優良農家品種，也是GAP研究的首選品種[4]。因為仁栝樓用途廣，目前種植方法得到的產量已經滿足不了市場日益增長的需求，鑒于栝樓繁育困難，可借助組織培養技術來解決此問題[5]。通過愈傷組織得到再生植株的組培技術，前人已經做了大量研究，但對仁栝樓組培快繁一步成苗技術尚未見報道。本研究應用植物組織培養技術，通過篩選不同激素組合誘導仁栝樓一步成苗的最佳培養基，探索出不經過愈傷組織這一環節的一步成苗快速繁殖培養方法，可以大大縮短組培時間，節省成本，提高成活率，盡快解決現在市場對種苗的需求。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗用仁栝樓來源于山東中醫藥大學藥圃，經山東中醫藥大學周鳳琴教授鑒定為葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim)，5月初從長勢良好的植株上取當年生的嫩腋芽做外植體。

1.2 培養方法

1.2.1 無菌外植體的獲得 外植體準備：剪取2 cm左右的栝樓嫩腋芽用2% 餐洗凈洗去灰塵后流水沖洗10 min，置于超凈工作臺上。75%乙醇浸泡外植體1 min，無菌水沖洗；0.1% 升汞(含吐溫-20)消毒3 min，無菌水沖洗5～6次，無菌濾紙吸干水分，備用。

1.2.2 一次性成苗培養基的確定 以MS為基本培養基，分別附加 6-BA 0.1、0.2、0.5 mg·L-13個水平，NAA0.1、0.2 mg·L-12個濃度水平進行試驗，共組成6種誘導培養基，每種培養基平行5瓶，每個三角瓶接種3個外植體，觀測并統計每種培養誘導外植體一次成苗的結果，確定一步成苗培養基最適配方。

1.2.3 培養條件 外植體常規消毒后，接種于100 mL三角瓶內，置于人工氣候箱中培養。培養條件：pH 5.8，瓊脂濃度0.7%，蔗糖含量3%，培養溫度25±1 ℃，光照強度2500 Lx，光照時間12 h·d-1。

1.2.4 結果統計 對接種后植株觀察其愈傷組織形態學變化。在接種后20 d觀察葉片大小、葉色、生長速度，測量試管苗高度。接種后 60 d統計再生植株頻率、根長度和主根數量，再生植株頻率=再生植株總數/接種的外植體數[6]。

2 結果和分析

2.1 愈傷組織形態學觀察

在培養過程中，無論能否誘導愈傷組織，葉片均能保持一段時間鮮綠。4～5 d 后，能夠發生愈傷組織的外植體，與培養基接觸的部分向上拱起 。10 d左右外植體邊緣開始出現顆粒狀膨大，隨后瘤狀突起向周圍擴展，15 d 左右形成明顯可見的愈傷組織，顏色為淺黃色。此時，仍有一些外植體，雖然仍是綠色，卻不能形成愈傷組織。20 d 左右，愈傷組織進一步膨大，表面粗糙如蘑菇云狀(圖1)。愈傷組織的顏色逐漸變深，說明15～20 d，為愈傷組織生長旺盛時期，最宜進行愈傷組織的繼代培養。若不轉移培養基，35 d左右愈傷組織塊底部長出白色絨毛細根，50 d左右形成根葉完整的一體苗 。

2.2 不同激素和濃度配比對仁栝樓一步成苗的影響

將仁栝樓嫩芽外植體接種在含 6種激素的 MS 培養基上，其一步成苗的結果見表1。6-BA濃度較高的 2號、4號和6號培養基葉片較小，顏色較淺，生長緩慢且較矮小。而1號、3號和5號培養基葉片較大，顏色較深，生長較快并且長勢較高，尤其5號培養基植株長勢最好(圖2、3)。

表1 不同培養基對仁栝樓再生苗的影響 (n=15)

圖1 4號培養基接種20 d生長情況

圖2 5號培養基接種60 d生長情況

圖3 1號培養基接種60 d生長情況

2.3 不同激素濃度對仁栝樓再生和生根情況的影響

接種后30 d時，栝樓試管苗開始長出大量的白根，同時成長的茁壯的植株速度減慢。1號、2號、6號主根個數較少，生長緩慢，隨著NAA濃度增加和6-BA濃度減小，3號、4號、5號培養基的根個數增多，并且生長速度快長勢較好(圖4，圖5)。5號培養基其地上部和根部均有旺盛的長勢，且植株再生頻率高。接種后60 d栝樓苗的生長情況統計結果見表1。通過對比認為，6種培養基中，以5號培養基MS+0.1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA為仁栝樓最合適的一步成苗培養基。

2.4 煉苗與移栽

當試管苗生長出發達的根系。將試管苗從人工培養箱移至自然條件下，1 d后松開瓶口，3 d后打開瓶蓋煉苗，7 d后取出試管苗洗去根部培養基栽入育苗基質中，注意保持一定的濕度。30 d后統計移栽成活率為77.1%。移栽成活后植株如圖6。

圖4 6號培養基接種30 d根生長情況

圖5 5號培養基接種30 d根生長情況

圖6 移栽后15 d生長情況

3 討論

通常栝樓傳統生產繁殖靠種子、分株等方法，在很大程度上限制了大面積的推廣栽培，進行離體高效快繁可以解決這一問題。通過愈傷組織再分化芽苗途徑可以有效的提高增殖系數，但外植體誘導愈傷組織的周期較長、獲得不定芽速度較慢、試驗次數較多，且愈傷組織長期連續增殖極易發生退化和變異等缺點。因此，相對于愈傷組織再分化芽苗來說，腋芽增殖并同時生根這一途徑，不僅成苗速度快，繁殖系數高，而且遺傳穩定性強，能在短期內獲得大量良種苗，有效解決良種苗匱乏的現狀。

在實際的生產過程中，普通快繁需要經過誘導、繼代、壯苗和生根四個階段的培育，且分別使用不同的培養基。如果用一種或兩種培養基實現四個階段的培養，得到移栽苗，既可簡化生產程序，提高培養效率，又能縮短育苗周期，降低生產成本。這也是衡量培養基配方是否理想的重要標準。

本研究建立了由腋芽再生完整植株的栝樓一步成苗快速繁殖體系，從接種外植體到試管苗僅需60天，將傳統組培快繁技術育苗周期縮短一半?？稍诙虝r間內大量繁殖栝樓種苗，為栝樓種植業生產提供優質種苗。且其方法簡捷，經濟實用，可操作性強。因此可進行推廣使用以及工業化生產，達到快速增殖的目的。

致謝：本項目在山東中醫藥大學大學生創新創業訓練平臺完成，獲得學校2013年度大學生研究訓練計劃(SRT)項目立項資助，項目編號2013266；韓琳娜博士為本項目指導教師。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1996：244-245.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：104-105.

[3] 姚紅麗，仝進毅.天花粉蛋白在婦產科臨床應用進展[J].浙江中西醫結合，2013，23(11)：954-956.

[4] 郭慶梅，周鳳琴，李定格等.瓜蔞的名稱、原植物和產地的本草考證[J].中醫研究，2006，19(3)：28-29.

[5] 高麗紅.栝樓愈傷組織的培養[J].科苑觀察，2010，23(05)：27-28.

[6] 曾愛松，宋立曉，高兵等.結球甘藍小孢子胚植株再生體系的優化[J].江蘇農業學報，2013，29(1)：228-230.

In-vitroRegenerationofOneStepSeedlingsforTrichosantheskirilowiiMaxim.

RONGJunming，HANLinna*，GUOQingmei*

(CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China)

To solve the problems of breeding and the large demand of seedling ofTrichosantheskirilowii，a fast regeneration system of one step seedlings was established forT.kirilowii.The optimum regeneration medium was MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1and the plant regeneration frequency reached 5.4.The survival rate of seedling transplanting could reach 77.1%.The technology of one-step seedlings forT.kirilowiican shorten the breeding cycle greatly.

TrichosantheskirilowiiMaxim；tissue culture；one-step seedling breeding

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.012

2014-11-26)

山東省科技發展計劃2011GSF11094

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韓琳娜，博士，副教授，研究方向為分子生藥學，E-mail：linnahan@163.com 郭慶梅，教授，博士，主要從事中藥質量控制與資源的研究，E-mail: qmguo@sina.com