臍帶血血清分離培養人胎盤間充質干細胞＊

周心濤，趙黎丙，閔新文，陳 嬌，郎明健

(湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北十堰 442000)

來源于正常足月分娩胎盤的人胎盤間充質干細胞(human placenta mesenchymal stem cells，PMSCs)具有來源廣、免疫原性低等優點，還具有自我更新和無限增殖的能力，能向多譜系分化[1－2]。本實驗通過利用正常足月分娩的臍帶血清(umbilical cord blood serum，UCBS)分離、培養PMSCs，觀察細胞形態、數量、擴增所用時間、細胞周期及培養前后細胞的表型、分化能力的改變，探討UCBS分離、培養及擴增PMSCs的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

L-DMEM(Gibco)、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(北京天根生物技術有限公司)，L-谷氨酰胺、MTT kit(Promega)。間充質干細胞成脂、成骨分化試劑盒(廣州賽業生物技術有限公司)。

1.2 UCBS 制備

無菌條件下取健康產婦足月臍血，4℃靜置4～16 h，20℃、1 500 g離心10 min收集上層血清，0.22 μm濾器過濾，56℃水浴 30 min滅活補體，－20℃保存備用。

1.3 PMSCs分離、培養及擴增

經孕婦本人及家屬知情同意、醫院倫理委員會批準，無菌條件下取健康胎兒(血清學檢查HBV，HCV，HIV和梅毒均為陰性)小塊胎盤組織，PBS充分洗滌后剔取胎兒面脫膜并剪碎。0.1% Ⅳ型膠原酶消化15～30 min，100目篩網過濾，收集細胞接種于T75細胞培養瓶，分別以含10%UCBS(實驗組)和10%FBS(對照組)的α-MEM培養基于37℃，5%CO2的飽和濕度環境下進行培養。培養生長至80%融合后(1～2周)，用0.05%的胰酶消化傳代。

1.4 PMSCs相關鑒定

1.4.1 PMSCs體外誘導分化 將實驗組與對照組中生長至第3代的PMSCs，以低密度接種至6孔板，第2天將基礎培養液更換為誘導液。成骨誘導液為高糖 DMEM、10%UCBS、地塞米松(10～8 mol/L)、磷酸甘油(10 mmol/L)及抗壞血酸(50 g/mL)。成脂肪細胞誘導液為高糖DMEM、10%UCBS、地塞米松(1nmol/L)、0.5 μmol/L 3-isobutyl-1-methylxantine、5 mg/L胰島素及200 mg/L吲哚美辛。每2～3 d換液1次。誘導2～4周后，分別用茜素紅(成骨細胞)和油紅O(脂肪細胞)染色鑒定。

1.4.2 PMSCs表面標志鑒定 將實驗組與對照組中生長至第5代的細胞，用0.05%胰蛋白酶消化后，調整細胞密度至1×106/mL，分為每管100 μL，分別加入鼠抗人 CD105(PE，Sigma)、CD34(PE，Sigma)、CD45(CY5，Sigma)、HLA-DR(FITC，Sigma)、CD44(FITC，Sigma)及 CD29(FITC，Sigma)單克隆抗體，避光4℃孵育30 min，4%多聚甲醛固定后流式細胞儀進行檢測。

1.5 不同血清對PMSCs增殖活性的影響

MTT法檢測不同血清對PMSCs增殖活性的影響，用0.05%胰蛋白酶分別將實驗組與對照組中生長至第4代的PMSCs消化成單細胞懸液，調整濃度為104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，每組細胞培養液根據不同的時間點，各設置5個平行孔和一個空白對照。按試劑盒操作指南分別于接種后的第1、3、5、7 天每孔 20 μL加入 MTT工作液。37℃、5%CO2孵育4 h后，用酶標儀在490 nm處測定OD值。

2 結果

2.1 PMSCs的鑒定

2.1.1 PMSCs形態 實驗組 PMSCs在2～3 d時開始貼壁生長，貼壁細胞呈梭形，形態飽滿，以后細胞數逐漸增多形成漩渦狀集落，原代細胞培養1～2周達80%以上融合后可傳代。對照組PMSCs在3～4 d時開始貼壁生長，細胞形態與實驗組無明顯差異。兩組細胞傳代后生長速度均明顯加快，約4 d可傳代1次。傳代2～3次后細胞純度提高，形態較原代均一，呈平行排列或漩渦狀生長，見圖1。

2.1.2 PMSCs體外誘導分化 實驗組細胞在進行成骨細胞誘導時，隨著誘導的進行，PMSCs由梭形逐漸變成方形，并開始出現聚集。誘導21 d后茜素紅染色可以將胞質被染成紅色，且實驗組茜素紅染色陽性細胞明顯多于對照組;成脂誘導后PMSCs逐漸開始出現油滴，誘導28 d后油紅O染色陽性，實驗組與對照組間差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

2.1.3 PMSCs表面標志 經流式細胞術檢測，無論是實驗組還是對照組中，PMSCs都高表達CD29、CD44及CD105，不表達或低表達 CD34、CD45及HLA-DR，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3。

2.2 MSCs在含UCBS培養液中的生長曲線

PMSCs在實驗組與對照組中培養時均表現為第2～5天成對數生長，第6～7天后進入平臺期，生長變緩，而且實驗組的增長率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，圖4。

3 討論

PMSCs是從人胎盤組織中分離的一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，除了能分化為脂肪、軟骨、成骨細胞等本胚層細胞外，在適當的條件性還能轉分化為骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞及神經細胞等胚層的細胞。PMSCs在缺血性卒中、帕金森氏癥及脊髓損傷等各種神經功能障礙疾病模型中的治療效果已經得到了證實[3]，但常規用于PMSCs體外培養的FBS中含有異源性蛋白及未知的細胞因子，這些蛋白和細胞因子可能會對人體有害，因而影響MSC的臨床應用[4]。

圖1 實驗組和對照組培養PMSCs原代細胞生長形態(40×)Fig.1 The morphology of PMSCs in experimental and control groups

圖2 PMSCs體外成骨和成脂誘導分化(200×)Fig.2 Osteogenesis and adipogenesis differentiation of PMSCs in vitro

圖3 PMSCs的免疫表型鑒定Fig.3 The immunophenotype identification of PMSCs

圖4 PMSCs在兩種培養液中的生長曲線Fig.4 The growth curves of PMSCs in the two groups

近年，很多人源性的替代品已經被用來代替動物血清進行干細胞培養，并取得了理想的效果[5]。UCBS比FBS含有更高濃度的細胞因子和生長因子，有利于干細胞擴增，細胞形態更好、免疫原性更低[6－8]。利用UCBS代替FBS培養人骨髓來源的MSC(human bone marrow-derived MSC，BM-MSC)，在連續傳代的過程中一直保持MSC的形態和高的增殖活性[9－11]。有學者利用處理過的臍帶血漿分離的帶間充質干細胞(human umbilical cord-derived MSC，hUC-MSCs)能保持較高的增殖活性和分化潛能[12]，CBS培養的MSC即使在高代數時仍具有較高的克隆形成潛能和MSC相關特性[13]。UCBS培養各種MSC的報道較多，但用于分離PMSCs的報道并不多見。UCBS、PMSCs及 hUC-MSCs同為胎兒附屬物，理論上UCBS中所含細胞因子的濃度、比例等應該更適合PMSCs及hUC-MSCs的生長。本研究利用UCBS進行PMSCs的分離培養，并對培養的結PMSCs進行鑒定。結果顯示PMSCs在含UCBS的培養液中可穩定生長，顯微鏡下其形態呈梭形，達到一定的密度后呈漩渦狀生長，復蘇及傳代貼壁率、貼壁時間都正常，在成骨誘導培養液中培養21 d后茜素紅染色成棕紅色，成脂誘導28 d后油紅O染色陽性;流式細胞分析檢測其高表達 CD29、CD44 及 CD105，低表達 CD34、CD45 及HLA-DR。PMSCs在含UCBS的培養液中能長期穩定生長，并保持其活力和間充質干細胞特性。而且PMSCs在UCBS培養液中的增殖率明顯高于含FBS的培養液。表明UCBS可以替代FBS用于分離、純化、培養、擴增PMSCs，因人臍帶血血漿完全是人源性的，可符合臨床對PMSCs的培養要求。

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