7對豬源性成分檢測相關引物的特異性評測

顧佳瑛 薛超波 宋蓉 林昕 管峰

摘 要：為了評測物種鑒定PCR體系的特異性及其影響因素，實驗對豬源性成分鑒定相關的7對引物就退火溫度、鎂離子濃度和不同Taq酶的影響進行了研究。結果表明，退火溫度和鎂離子濃度對PCR特異性有著重要影響，而其中2對引物優化后仍與鼠、兔、牛、羊、雞和鴨有非特異性擴增。不同的Taq酶對引物特異性也有重要影響，本實驗中r Taq酶在7對引物PCR體系中特異性最佳。通過對引物體系的優化和選擇不同的Taq酶，可以有效提高特異性，減少非特異性擴增，為建立物種鑒定的PCR體系及多重PCR提供了基礎。

關鍵詞：豬；物種鑒定；引物；特異性評測

中圖分類號 S828.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）17-121-04

Assessment and Determination of Specificity of Seven Pairs of Primers for Porcine Identification

Gu Jiaying1 et al.

（1College of Life Science，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

Abstract：To assess and determine the specificity of PCR system for species identification，seven pairs of primers for porcine identification were used to assess the effects of annealing temperature，concentration of MgCL2 and different Taq DNA polymerase on PCR specificity in this study. The results showed that there had two of seven pairs of primers had nonspecific amplification with rat，rabbit，bovine，ovine and chicken after optimization of PCR conditions. After PCR conditions were optimized for each pair of primers，including annealing temperature，concentrations of MgCL2 and dNTP，different Taq DNA polymerases. The PCR specificity was improved but not significantly. The results indicated that rTaq polymerase enzyme performed best to ensure the specificity of seven pairs of primers. This study could provide some guidance for development multiplex PCR methods of species identification.

Key words：Pig；Species identification；Primer；Specificity assessment

隨著社會經濟的發展，肉類已經成為人們食品來源的重要組成部分，現代肉類加工業及食品行業的快速發展更是促進了肉類食品多樣化的快速發展。肉類食品摻假問題一直是大家非常關注的話題，由于近幾年來各種“假羊肉”和歐洲馬肉風波等多個制假摻假肉類事件屢禁不止，消費者對肉類質量與安全性的關注和要求也越來越高。盡管世界各國都在加強對肉食品的監管監督，但世界范圍內的食品摻假仍然有不斷增加的趨勢，在一定程度上影響了消費者對食品行業的信心。近些年來，我國查處了多起用廉價的或者不合格的豬肉、雞鴨肉甚至狐貍肉等冒充牛羊肉制品在市場銷售事件。肉類摻假問題不僅損害消費者的經濟利益，更重要的是可能危害消費者的身體健康，甚至會帶來一些宗教信仰等社會問題，因此，對肉類摻假的檢測就顯得尤為重要。另外，牛羊的肉骨粉由于“瘋牛病”的潛在隱患，也是世界動物衛生組織明令禁止的[1]。在檢測方面，國內外制定了諸多對于常見肉類的檢測方法標準，我國也有牛羊豬等物種成分的檢測方法[2-5]，但大部分動物源性成分鑒定的現行國家標準存在諸如檢測效率低、對于未知物種無法檢測、對儀器要求高等不足，在檢測應用的同時無疑增加了檢測成本。

在物種鑒定方法發展過程中，基因組DNA尤其是線粒體DNA（mtDNA）由于具有穩定性好、不受組織來源和外在形態等影響的特點，逐漸成為了DNA分析技術中的首選靶標，也是當今“DNA條形碼”技術的首選靶標。如今，PCR及其衍生技術作為DNA檢測的主要手段被廣泛應用，而引物的特異性和試劑是影響PCR特異性的主要因素[6-8]。多重PCR技術在物種鑒定中具有快速簡便的優越性，但多重PCR體系也對引物的特異性和體系的穩定性提出了更高的要求。為了評測PCR體系特異性的影響，本研究對豬源性成分鑒定相關的6對和1對自行設計的PCR引物進行了特異性和影響因素評測，探究PCR特異性的影響因素，為建立多重PCR提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試劑 牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、牛蛙、魚（鯽魚和小黃魚）均購自超市肉類專柜；兔肉、水牛血樣和小鼠肝臟為實驗室保存的研究樣品。按照動物組織或血液DNA提取試劑盒指導提取基因組DNA，用TE溶解后放4℃備用。r Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司、Easy Taq DNA Polymerase購自TRANS公司、Dream Taq酶購自Fermentas公司，DNA Taq酶和高保真Taq酶購自Thermofisher公司，其他試劑均為國產常用分子生物學試劑。DNA提取后用NanoDrop 2000 UV-Visspectrophotometer進行質量檢測，測定濃度和A260/280值。

1.2 引物設計 本研究選用了6對來自文獻與豬檢測相關的引物和1對自己設計的豬源性成分特異性鑒定引物，引物序列和文獻來源等信息見表1。

表1 豬的檢測引物信息

[引物

編號＼&基因序列

（5′-3′）＼&檢測

對象＼&文獻

來源＼&引物

對I＼&GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA＼&豬＼&[5，9，10]＼&ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG＼&引物

對II＼&AATTTTTGGGGATGCTTAGACT＼&豬＼&[11]＼&TATTTTGGGAGGTTATTGTGTTGTA＼&引物

對III＼&GAAAAATCATCGTTGTACTTCAACTACA＼&豬＼&[12，13]＼&GGTCAATGAATGCGTTGTTGAT＼&引物

對IV＼&CTGGTCTTGTAAACCAGA＼&豬、牛、

羊＼&[14]＼&CCATCGAGATGTCTTATTTAAGAGG＼&引物

對V＼&CCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA＼&豬＼&[15]＼&GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA＼&引物

對VI＼&ACGCCAATCTACCACAAA＼&豬＼&自己設計＼&TGGCTGGCACGAGATTTA＼&引物

對VII＼&AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA＼&多物種＼&[16，17]＼&GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA＼&]

1.3 PCR參考條件及特異性評 依據文獻報道的PCR條件，在既定條件下測試PCR體系對于物種DNA的非特異性擴增情況，依此評測引物的特異性，具體PCR體系和程序參閱表1各文獻。引物對VI的反應體系為20μL，其中Buffer緩沖液2.0μL，上下游引物各2.0μL，dNTP 1.6μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，MgCl2 1.6μL，DNA模板3.0μL（約含30ng DNA），ddH2O補充至20.0μL。反應程序為95℃變性5min；95℃變性30s，退火58.5℃、30s，72℃延伸30s為一個循環，共計30個循環；然后72℃保持5min。其測試所用DNA模板包括水牛、奶牛、山羊、綿羊、鹿、雞、鴨和魚類。PCR產物經電泳后使用凝膠成像儀進行觀察。經PCR擴增后獲得目標產物與預期大小一致且條帶清晰則認為特異性好，反之亦然。

1.4 PCR條件優化及特異性檢測 針對如上7對引物，按照20μL的PCR體系，進行退火溫度（45～65℃）、MgCL2濃度（1.5～3.0mM）、引物濃度（0.05～1μM）和dNTP濃度的優化，豬DNA模板添加量固定為約30ng。條件優化后同樣以水牛、奶牛、山羊、綿羊、鹿、雞、鴨和魚類的DNA為模板，測試PCR體系的特異性。

1.5 不同DNA聚合酶對PCR體系特異性的影響 為篩選特異性好且成本較低的試劑材料，用優化后的PCR體系對7對引物使用不同的DNA Taq聚合酶進行PCR擴增，篩選Taq酶與PCR體系的組合，所用Taq酶包括r Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶、Easy Taq DNA Polymerase、Dream Taq酶、EX Taq酶、Easy Taq DNA Polymerase和Thermofisher公司的DNA Taq酶以及高保真Taq酶。實驗重復3次。

2 結果

2.1 基因組DNA檢測 對提取的基因組DNA檢測結果表明，濃度在80～220ng/μL，A260/280在1.78～2.08，電泳條帶有部分拖尾現象。

2.2 固有條件下特異性檢測結果 按照文獻報道的PCR體系和反應程序，使用Takara公司的EX Taq酶對各引物PCR體系特異性評測。其中引物對I可以特異性擴增豬基因組DNA，產物大小為212bp，且條帶清晰，對羊、雞、鴨、鼠、兔DNA沒有非特異擴增，但是對牛DNA有非特異性擴增。引物對II對豬DNA有特異性擴增，擴增產物大小為712bp，與牛、羊、雞、鴨、鼠、兔DNA沒有非特異擴增產物（如圖1所示）。引物對III雖然也可以特異性擴增豬DNA，擴增產物大小為100bp，但與牛、羊、雞、鴨、鼠、兔DNA都有非特異擴增，且條帶明顯。根據文獻報道，引物對IV是一對多物種檢測引物，可以特異性的擴增牛、羊、豬DNA，結果證明對牛、羊、豬均有特異性擴增，豬的擴增產物大小為605bp，牛的擴增產物大小為662bp，羊的擴增產物大小為915bp，但對鼠、兔DNA有明顯的非特異擴增（如圖2所示）。引物對V對豬DNA有特異性擴增，擴增產物大小為387bp，對牛、羊DNA也有非特異擴增，但同等條件下電泳顯示的條帶亮度比豬的產物明顯要弱。引物對VI可特異性擴增豬DNA，產物大小為420bp，但對兔有很弱的非特異性擴增。引物對VII是針對16S rRNA基因設計的引物，可以擴增多個物種的基因組，本實驗中該引物可特異性擴增所有基因組DNA，其中豬的擴增產物大小為239bp，牛、羊的擴增產物大小為234bp，雞的擴增產物大小為249bp，與預期結果一致（如圖3所示）。

[M 1 2 3 4 5 6 7]

圖1 引物對II PCR產物檢測

注：M為GM334 DNA marker；1-7依次為：牛、羊、豬（712bp）、雞、鴨、鼠、兔。

[M 1 2 3 4 5 6 7]

圖2 引物對IV PCR產物檢測

注：M-GM334 DNA maker；1-7依次為：豬（605bp）、牛（662bp）、羊（915bp）、鼠、兔、雞、鴨。

圖3 引物對VII PCR產物檢測

注：M-GM334 DNA maker；泳道1-10：豬、牛、水牛、羊、雞、鴨、牛蛙、魚、鼠、兔。

2.3 條件優化后的特異性檢測結果 對具有非特異性擴增的引物體系進行PCR優化。優化后引物對I能擴增豬DNA而對本測試中其他物種無擴增。引物對III優化后在退火溫度達到66.5℃時對豬DNA仍有很好的特異性擴增，擴增產物大小為100bp，但仍無法消除對牛DNA的非特異性擴增。引物對IV優化后特異性擴增牛、羊、豬DNA，但值得注意的是，該引物在提高鎂離子濃度和退火溫度后，兔的非特異性擴增產物條帶亮度顯著降低，仍無法完全消除對兔和鼠DNA的非特異性擴增，需降低電泳分辨率才能消除這種非特異性擴增的影響。引物對V在優化后仍無法消除對牛羊DNA的非特異性擴增，而引物對VI優化后對豬之外的測試物種無非特異性擴增。引物對VII是一個多物種擴增的引物，對測試物種能在寬泛的PCR條件下擴增動物的16S rRNA基因，是一個很好的可供用于動物基因組檢測的參照基因。

2.4 不同酶對特異性的影響 Taq酶是PCR反應的重要成分，對PCR的特異性和擴增量有著直接影響，不同的酶在活性、保真性和性價比方面差異較大[7]。本實驗中在用TaKaRa公司的EX Taq酶對上述7對引物擴增后，更換Taq酶進行PCR反應，結果表明，針對引物對I在其他條件不變的情況下，r Taq酶具有相對較高的特異性和經濟性，相比EX Taq酶減少了牛的非特異擴增。引物對VI在其他條件不變的情況下，使用r Taq酶和Thermofisher公司的DNA Taq酶時引物的特異性無顯著變化，但是目的擴增產物電泳亮度顯著提高，當PCR程序降低至26個循環時非特異性擴增在電泳中不可見。在其他5對引物PCR反應體系中，r Taq酶和Thermofisher公司的DNA Taq酶以及高保真Taq酶都能特異性擴增目的物種的DNA，且不同Taq酶之間的擴增效果無明顯差別。

3 討論

近幾年，肉類食品摻假問題層出不窮，備受社會關注，不法商販為謀求利益，將相對便宜的豬肉、雞鴨肉甚至狐貍肉等進行處理，冒充價格較貴的牛羊肉或做成休閑食品。肉類摻假問題不僅影響經濟、食品營養價值和食品安全等，還帶來一系列社會問題，影響社會誠信，并且可能帶來一些宗教信仰問題。另外，動物飼料中添加明令禁止的牛羊源成分現象屢有發生，也給動物養殖行業帶來了潛在風險。因此，動物源性成分溯源鑒定是當今社會監督監管和嚴格執法的需要。

物種鑒定或飼料中動物源性成分的鑒定經歷了感官檢驗和形態學檢驗的過程，隨后發展了蛋白質分析方法，如ELISA法、免疫法、等電聚焦等方法。但在肉類加工的過程中，由于腌制、蒸煮、混合或者加入各種調料會使蛋白質的結構和穩定性遭到破壞，物種特有的蛋白質或抗原決定部位也會遭到破壞，因此對于深加工后的肉類蛋白分析法存在不足，如ELISA法難以對混合肉的物種進行鑒別[18]。核酸分析是伴隨著蛋白成分檢測發展起來的物種鑒定技術，主要是PCR及衍生技術，由于PCR反應時間較短、操作簡單、成本低，并且有較高的靈敏度和特異性，成為了物種鑒定中最常用的的技術[19]。PCR技術目前已經發展了多種技術，在物種鑒定研究中得到廣泛應用，目前多個物種如豬[2，5]、牛羊[2，4]等都采用了PCR鑒定技術。PCR技術的特異性和靈敏度除了引物外還受到反應體系內所有試劑的影響，包括DNA模板濃度和質量、DNA聚合酶、MgCL2濃度等。DNA模板的質量是影響PCR的重要因素，模板DNA中目的基因的原始拷貝數對PCR結果有著重要的影響，濃度較高、結構完整且雜質少的DNA模板可提高PCR效率。模板DNA提取過程中有機溶劑的殘留會影響DNA聚合酶的活性而影響擴增效率。在物種檢測和溯源研究中有時候由于獲得微量樣品，DNA提取存在不可重復性，因此往往需要對PCR體系進行優化，以達到最大化擴增DNA模板的效果。本研究中使用了動物組織作為DNA提取的材料，盡管樣品來源和處理不同，從實驗結果來看提取的DNA質量足以滿足本研究的需要。另一方面，由于本研究中PCR均以mtDNA為靶標，由于mtDNA的穩定性好，本研究中所有提取的DNA均能滿足PCR擴增的需求。同時合適的MgCL2濃度是保證Taq酶活性的基本條件，其濃度的優化可以提高PCR體系的特異性。Taq酶對PCR體系特異性的影響較為顯著，Taq酶種類和特點以及自身的5′→3′聚合酶活性和外切酶活性以及3′→5′外切酶活性對于PCR的特異性都存在影響[7-8]。本研究中的EX Taq酶具有3′→5′外切酶活性，可對dNTP的錯配進行校正，保真性好，但是擴增效率并不高。與此同時，EX Taq酶的擴增條件更為嚴格，溫度范圍和鎂等離子濃度范圍更窄，PCR特異性與嚴格的條件優化有關，否則難免有非特異性擴增。rTaq酶沒有3′→5′外切酶活性，保真性相對較低，但它的擴增條件較為寬泛，在本實驗測試中相對特異性較好。本實驗經過對比7對豬源性成分鑒定相關的PCR引物，測試結果表明，實驗條件中溫度、鎂離子濃度和不同批次及廠家的Taq酶對PCR的特異性均有影響，其中溫度、鎂離子濃度2個條件可以通過PCR優化降低影響，提高特異性。而不同酶的測試表明，不同的酶有不同的活性，對PCR特異性造成一定影響，因此，要根據擴增產物片段大小以及實驗需求來選擇合適的Taq酶。

綜上研究表明，在物種PCR鑒定中應注意鎂離子濃度、退火溫度和不同Taq酶的選用，通過優化鎂離子濃度、退火溫度和選擇合適的Taq酶可以有效提高檢測的準確性。同時本研究也為將來建立多重PCR檢測多物種的方法提供了基礎。

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（責編：張宏民）