石化工業污水中分離篩選苯酚降解菌及其降解率研究

丁海燕+張國發+武燕+馮偉

摘 要：自然界中某些微生物具有較強的酚降解能力，利用微生物處理含酚廢水的方法受到了越來越廣泛的重視。該文通過梯度平板法從石化工業廢水中分離篩選得到3株降解酚的細菌，苯酚降解率分別為90.9%、82.5%、74.9%。對其進一步深入研究，進而將其應用到工廠等污水處理方面，降低含苯酚的廢水排出，具有一定的指導意義。

關鍵詞：石化工業污水；苯酚降解菌；降解率

中圖分類號 X505 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）17-33-03

Isolation and Screening of Phenol Degrading Bacteria and its Degradation Rate in Petrochemical Industry Wastewater

Ding Haiyan et al.

（Daqing Normal University，Daqing 163712，China）

Abstract：Some microorganisms in nature have a strong ability to degrade phenol. The method of treating phenol wastewater by microorganism has been paid more and more attention. In this article，three strains of bacteria were isolated and screened from the petrochemical industrial wastewater by gradient plate method.The degradation rate of phenol was 90.9%，82.5% and 74.9%. It has guiding significance for further study，and then appling to the plant and other wastewater treatment，reducing the wastewater containing phenol wastewater discharge.

Key words：Petrochemical industrial wastewater；Phenol-degrading bacteria；degradation rate

含酚廢水主要來自各類化工廠以及合成有機農藥、染料等生產過程中，未經及時處理或分解，直接排放到河流中，造成了水源污染。酚是一種有毒物質，能與蛋白質發生化學反應，濃度小時可使細胞變性，濃度大時可使蛋白質凝結，酚類化合物都具有氣味，有酸性，在空氣中容易被氧化。含酚廢水對環境的危害極大，造成了嚴重的水污染，在許多工業領域的廢水中均含有苯酚。目前常用的苯酚的清除方法有如下2種，物理化學藥劑的費用高，易造成再次污染；微生物處理含酚廢水的方法費用少、效果好。研究表明，自然界中某些微生物具有很強的降解苯酚能力，微生物法處理苯酚方法越來越被廣泛應用。近年來，從被酚類物質污染的環境中分離到了多種降酚微生物菌株，如假絲酵母（Candida Albicans）[1]、假單胞菌（Pseudomonadaceae）[2]、醋酸鈣不動桿菌（A.calcoaceticus）[3]、根瘤菌（Rhizobium）[4]、藻類[5]、真養產堿菌（Alcaligeneseutrophus）[6]等。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源 從大慶某化工廠取出的含酚廢水，裝入無菌的玻璃瓶中，拿回實驗室進行菌種的分離。

1.1.2 實驗所用培養基及試劑 （1）耐酚細菌培養基：牛肉膏6g/L，蛋白胨12g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂16g/L，pH為7左右，121℃滅菌20min。（2）苯酚無機培養液：MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.3g/L，pH7.0～7.2，苯酚25mg，蒸餾水100mL，分裝三角瓶，每瓶30mL，121℃滅菌20min。（3）碳源對照培養液A：葡萄糖25～75mg，尿素0.1g，微量元素10mL，蒸餾水90mL，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。（4）微量元素溶液：MgSO4.7H2O 0.3g/L，KH2PO4 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，CaCl2 0.005g/L。（5）苯酚培養液B：苯酚25～75mg，尿素0.1g，微量元素10mL，蒸餾水90mL，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。（6）無菌生理鹽水：濃度為9%的鹽水，121℃滅菌20min。

1.2 方法

1.2.1 梯度平板法分離 （1）梯度平板的制備：量取12mL不含苯酚的無菌耐酚培養基倒入直徑為9mL的培養皿中，然后立刻將此培養皿斜著放置，讓培養基固定成斜面狀，并讓培養基覆蓋平板底部，凝固后放平，再加入12mL無菌的含苯酚耐酚細菌培養基，正好凝固成平面。（2）樣品液稀釋：將采集的含酚廢水樣品作10倍系列稀釋。（3）涂布平板：用1mL移液管分別吸上述10-3、10-2、10-1和原液4種樣品液0.1mL，滴在上述相應的梯度平板上，用涂布棒涂布菌液，使菌液分散開來，每種濃度作3個重復。（4）培養：將上述涂布了樣品液的平板倒置于30°恒溫箱中培養1～2d。（5）涂布法分離結果觀察：從30℃恒溫箱中取出分離平板，觀察平板上耐酚細菌的生長狀況。（6）耐酚細菌純化：用無菌接種環挑取苯酚高濃度一側單菌落的菌苔在含苯酚的耐酚細菌平板上三區劃線純化，培養后挑取單菌落接種到耐酚細菌斜面上，30℃培養3d。

1.2.2 耐酚細菌分離純化及馴化 將采集的含酚廢水加入含30mL苯酚無機培養液的三角瓶中，30℃培養3～5d，再添加3次苯酚無機培養液，從中選出在苯酚中能存活下來的菌株，對其進行馴化。

1.2.3 生長曲線測定 （1）標記：取5支無菌大試管，用記號筆分別標明培養時間，即：0、12、24、36h和48h。（2）接種：分別用5mL無菌吸管吸取2.5mL過夜培養液（培養10～12h）轉入盛有30mL碳源對照液A和苯酚培養液B的三角燒瓶中，混合均勻后分別取5mL混合液放入上述標記的5支無菌大試管中。（3）培養：將已接種的試管置搖床30℃振蕩培養48h（振蕩頻率4 000r/min），分別培養0、12、24、36和48h，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁，測定其光密度值。（4）比濁測定：用未接種的LB液體培養基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從中取出的培養液開始依次測定，對細胞密度大的培養液用LB液體培養基適當稀釋后測定，使其光密度值在0.1～0.65（測定OD值前，將待測定的培養液振蕩，使細胞均勻分布）。

1.2.4 性能測定 （1）初篩。含不同苯酚B平板制備：按常規方法制備，苯酚終濃度分別為25mg/100mL、45mg/100mL、60mg/100mL、75mg/100mL。將分離純化的耐酚能力強的菌株分別劃線接種于上述制備的平板上，30℃培養1～2d。（2）復篩。用無菌接種環挑取一環經初篩獲得的菌種菌苔轉接于含30mL不含苯酚的耐酚細菌培養液的三角燒瓶中，30℃振蕩培養1d后，將培養液離心5min，留沉淀，用生理鹽水離心沖洗1次，最后用無菌生理鹽水制備一定濃度的菌懸液。

1.2.5 苯酚降解率測定 以高濃度苯酚培養液中生長速度下降不明顯者為出發菌株，接入含苯酚培養液B的三角燒瓶中，振蕩培養48h，并分別于0h和48h測定發酵液苯酚濃度，計算苯酚降解率。計算公式如下：

苯酚降解率（%）=（未酵前發酵液苯酚含量-發酵終止時發酵液苯酚含量）/未發酵前發酵液苯酚含量×100

1.2.6 發酵液中苯酚含量的測定 發酵液中苯酚具有在NH4OH-NH4Cl緩沖液中游離出來的特點。當游離出來的苯酚與4-氨基安替比林混合時，兩者可發生縮合反應。在氧化劑鐵氰化鉀作用下，酚被氧化成醌，并于4-氨基安替比林偶合而顯色。將適量發酵液加入到50mL容量瓶中，同時分別吸取酚標準液0、0.5、1、2、3、4和5mL于各容量瓶中，用蒸餾水稀釋至50mL，然后向酚標準溶液和發酵的稀釋溶液中各加入0.25mL20%氨性氯化銨緩沖液、0.5mL2%4-氨基安替比林溶液和0.5mL8%鐵氰化鉀溶液，每次加入試劑后需混勻，放置15min后在A510處比色測定苯酚標準曲線，從曲線圖中可查出發酵液中苯酚含量。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選及馴化結果 共篩選出3株對苯酚具有降解能力的菌落，分別編號為W1、W2、W3。3個菌株的菌落的形狀、透明度、顏色、邊緣、高度等形態特征，如表1所示。

表1 菌落的形態特征

[菌株＼&形狀＼&透明度＼&顏色＼&邊緣＼&高度＼&W1

W2

W3＼&不規則圓

不規則圓

圓形＼&周圍透明

不透明

不透明＼&中間褐色

乳白

金黃色＼&不整齊

不整齊

整齊＼&矮

較高

較高＼&]

2.2 苯酚降解細菌生長情況及苯酚降解率分析 將菌懸液接入含30mL苯酚培養液B的三角燒瓶中（接種量為50mg濕菌體/100mL培養液），30℃振蕩培養48h。期間分別于發酵的0h、12h、24h、36h、48h取樣測定光密度值，并繪制出生長曲線，見圖1，在25mg/100mL苯酚培養液中生長速度下降不明顯者為耐酚菌株。從圖1中曲線的趨勢并沒有明顯下降可以看出此細菌具有降解苯酚的能力，而曲線末端有一點下降的趨勢，則是因為在培養液中有少部分的細菌死亡。

[時間（h）]

圖1 不同時間苯酚溶液耐酚細菌OD值

W1菌株在苯酚為75mg/100mL的平板上有大量菌落生長，根據圖2可計算出苯酚降解率為91%～100%，W2菌株在苯酚為60mg/100mL的平板上有大量菌落生長，根據圖2可計算出苯酚降解率為81%～90%，W3號菌株在苯酚為45mg/100mL的平板上有大量菌落生長，根據圖2可計算出苯酚降解率為71%～80%，如表2所示。

[0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0][OD值][苯酚含量（mg）][0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06]

圖2 不同酚含量標準溶液的OD值

表2 耐酚細菌生長情況及苯酚降解率

[菌株＼&不同含酚濃度平板上生長情況＼& 苯酚降解率 ＼&0.025%＼&0.045%＼&0.060%＼&0.075%＼&<70%＼&71%～80%＼&81%～90%＼&91%～100%＼&W1＼&+＼&+＼&++＼&+++＼&＼&＼&＼&√＼&W2＼&+＼&++＼&+++＼&++＼&＼&＼&√＼&＼&W3＼&++＼&+++＼&++＼&+＼&＼&√＼&＼&＼&]

注：“-”表示沒有菌落生長，“+”表示有少數菌落生長，“++”表示有中等菌落生長“+++”有大量菌落生長。

3 展望

本文分離純化得到3株具有較強降解酚能力的菌株，并對其降酚特性進行了初步的研究。在今后的工作中，應進一步研究其與好氧工藝配合的降解能力，達到降解有毒底物所用時間較短；進一步研究菌株降解底物特性，并從生化機理上進行深入研究；通過各種育種手段提高菌的降解能力，如進行構造基因工程菌，優化細胞培養工藝，誘變育種，進而將其應用到工廠、焦化廠等污水處理方面，降低含苯酚的廢水排出，達到改善環境的目。

參考文獻

[1]劉相偉.工業含酚廢水處理技術的現狀與進展[J].工業水處理，1998（02）：1-4.

[2]周定，侯文華.固定化微生物生物處理含酚廢水研究[J].環境科學，1990，11（1）：126.

[3]孫福來.土壤有機污染物研究進展[J].農業環境與發展，2002（5）：29-31.

[4]陳明，張維.醋酸鈣不動桿菌PHEA22對苯酚降解特性研究[J].中國環境科學，2001，21（3）：226-229.

[5]Lee S G，Hung S P，Removal and bioconversion of phenol in waster water by z-thermostable β tyrosine[J].Enzyme and microbial technology，1996（19）：374-377.

[6]向述榮，陳秀榮.苯酚降解菌phen8的分離篩選及其16SrDNA序列分析[J].微生物學雜志，2002，22（6）：19-20.

（責編：張宏民）