微波輔助萃取馬齒莧抑菌活性成分的工藝優(yōu)化

曾秀桃，馬佳鳳，林 穎，朱 晨，王慧敏，徐麗珊

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004）

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科一年生草本植物，別名長(zhǎng)命草、五行草、瓜子菜、地馬菜等，是我國(guó)衛(wèi)生部劃定的87種藥食同源的野生植物之一[1]。其干燥地上部分，性寒味酸，具有清熱利濕、涼血解毒的功效。目前，已有研究表明馬齒莧對(duì)多種食品污染菌有較強(qiáng)的抑制作用[2]，以馬齒莧為原料，研制新藥或天然防腐劑已成為一種趨勢(shì)。研究馬齒莧抑菌效果的前提是有效提取其抑菌活性成分，而目前提取馬齒莧抑菌活性成份的相關(guān)研究較少。

天然產(chǎn)物中有效成分的傳統(tǒng)提取方法有浸漬法[3]、滲漉法[4]、煎煮法和回流提取法[5]等，但這些提取方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑用量大、操作麻煩等問題。與傳統(tǒng)提取方法相比，微波輔助萃取有提取快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)[6]，近年來已廣泛用于天然產(chǎn)物中揮發(fā)油[7]、多糖[8]、生物堿[9]、黃酮[10]等成分的提取。因此，試驗(yàn)以馬齒莧為試驗(yàn)材料，通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其活性成分進(jìn)行微波輔助萃取研究，旨在獲得最佳提取工藝，為馬齒莧有效成分在食品、制藥等領(lǐng)域的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料與菌種 馬齒莧材料購自菜市場(chǎng)，大腸 桿 菌（Escherichia coli）、 金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphyloccocu saureus）、沙門氏菌（Salmonella）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 值7.4～7.6。

1.1.3 主要儀器 微波消解儀（MDS-8G）、MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋電機(jī)株式會(huì)社）、超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、恒溫生化培養(yǎng)箱（SPX-450）、BPG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、CT 15RE日立臺(tái)式離心機(jī)（天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 將新鮮馬齒莧洗凈后烘干至恒重，粉碎備用，以蒸餾水為萃取試劑，以大腸桿菌抑制活性為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]。（1）微波功率：準(zhǔn)確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，料液比1︰50，萃取溫度為50℃、時(shí)間為12 m in，分別考察500、600、700、800 W 的微波功率對(duì)馬齒莧抑菌活性物質(zhì)提取的影響。（2）萃取時(shí)間：準(zhǔn)確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，料液比1︰50，萃取溫度為60℃、微波功率為500 W，分別考察3、6、9、12、15 m in 的萃取時(shí)間對(duì)馬齒莧抑菌活性物質(zhì)提取的影響。（3）萃取溫度：準(zhǔn)確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，料液比1︰50，微波功率為500 W、萃取時(shí)間15 m in，分別考察40、50、60、70℃的萃取溫度對(duì)馬齒莧抑菌活性物質(zhì)提取的影響。（4）料液比：準(zhǔn)確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，分別考察1︰30、1︰40、1︰50、1︰60、1︰70、1︰80 的料液比，在溫度為50℃、萃取時(shí)間15 m in，微波功率為500 W 的條件下，馬齒莧抑菌活性物質(zhì)的提取效果。將上述提取液減壓抽濾至25 mg/m L（料液比試驗(yàn)抽濾至10 mg/m L），測(cè)其對(duì)大腸桿菌的抑制直徑。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取萃取溫度、微波功率、萃取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行L（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12]，因素水平選取如表1 所示。并對(duì)正交試驗(yàn)所得的最佳組合進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.3 馬齒莧活性成分粗品提取產(chǎn)率計(jì)算 在最佳工藝條件下微波萃取得活性成分提取液，將其減壓濃縮后真空冷凍干燥得抑制大腸桿菌活性成分粗品，按公式（1）計(jì)算粗品的提取產(chǎn)率。

其中，ω 表示抑制大腸桿菌活性成分粗品提取產(chǎn)率（%）；x 表示粗提物質(zhì)量（g）；m 表示植物粉末質(zhì)量（g）。

1.2.4 馬齒莧對(duì)細(xì)菌的抑制活性及其最小抑菌濃度測(cè)定 （1）以蒸餾水為參照，采用牛津杯法[13]測(cè)定馬齒莧提取液（50 mg/m L）對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草桿菌的抑制活性。（2）分別制備25、12.5、6.25、3.13、1.56 和0.78 mg/m L 的馬齒莧活性成分溶液，采用牛津杯法則定其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率 由圖1 可知，隨著微波功率的增加，馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌的抑制活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，以700 W 處理得到的馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌的抑制直徑最大，達(dá)（16.50±0.63）mm。

圖1 不同微波功率獲得的馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌抑制活性的比較

2.1.2 萃取時(shí)間 由圖2 可知，在萃取3～6 min 時(shí)，隨著時(shí)間的增加，其提取液的抑菌效果不斷增強(qiáng)，當(dāng)萃取6 m in 時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)（13.25±0.25）mm；但在萃取6～12 m in 時(shí)，萃取時(shí)間對(duì)馬齒莧抑菌效果的影響差異不顯著。

圖2 不同萃取時(shí)間獲得的馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌抑制活性的比較

2.1.3 萃取溫度 由圖3 可知，隨著萃取溫度的升高，馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌的抑制活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，50℃下獲得的馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌的抑制直徑最大，達(dá)（13.67±0.46）mm。

圖3 不同萃取溫度獲得的馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌抑制活性的比較

2.1.4 料液比 由圖4 可知，隨著料液比比例的增加，提取液的抑菌效果呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1︰50 時(shí)，抑菌圈直徑最大，達(dá)（12.42±0.08）mm。

圖4 不同料液比獲得的馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌抑制活性的比較

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2 的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，極差最大的是萃取溫度（3.24），表明萃取溫度是影響馬齒莧抑菌活性成分提取的主要因素；其次是萃取功率（1.91）；而萃取時(shí)間對(duì)馬齒莧抑菌活性成分提取的影響最弱。由此可知，對(duì)馬齒莧抑菌活性成分提取影響程度從大到小排列依次為：A（萃取溫度）＞C（萃取功率）＞B（萃取時(shí)間）。由極差數(shù)值分析可得，最佳萃取條件組合為：A2B2C3，即萃取溫度50℃，萃取時(shí)間9 m in，微波功率800 W。

在萃取溫度50℃，萃取時(shí)間9 min，微波功率800 W，料液比1︰50 的提取條件下，對(duì)馬齒莧抑菌活性成分進(jìn)行提取，結(jié)果表明，該條件下馬齒莧提取物的抑菌直徑分別為13.33±0.44、14.16±0.22、13.67±0.17 mm，均比正交試驗(yàn)組合的抑菌直徑大，平均值為13.72 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為0.42。這表明提取工藝確實(shí)為最佳工藝組合。

2.3 最佳提取工藝下馬齒莧抑菌活性成分粗品的得率

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

取馬齒莧植物粉末400.000 g，采用最佳提取工藝（溫度50℃，時(shí)間9 m in，功率800 W，料液比1︰50）進(jìn)行微波萃取，最終制得馬齒莧提取物63.755 g，經(jīng)計(jì)算其得率為15.94%。

2.4 馬齒莧提取物對(duì)不同細(xì)菌的抑制活性及其最小抑菌濃度

由圖5 可知，馬齒莧提取物對(duì)沙門氏菌和枯草桿菌無抑制作用，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，其抑菌圈直徑分別為13.00±0.87 mm 和11.25±0.38 mm。

圖5 馬齒莧提取物對(duì)不同細(xì)菌的抑菌活性比較

從表3 中可以看出，馬齒莧提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性隨濃度的增大而增強(qiáng)，并且相同濃度的粗提物對(duì)不同供試菌的抑制效果不同，馬齒莧粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度（M IC）分別為6.25 和1.56 mg/m L。這表明馬齒莧對(duì)大腸桿菌的抑制效果較強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

馬齒莧是一種常見的野菜，在我國(guó)分布廣泛，資源豐富，儲(chǔ)量大且安全無毒[14]，同時(shí)該野菜還含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分及多種藥理成分。目前，已被公認(rèn)是亞麻酸、必需的ω-3 和ω-6 脂肪酸、抗壞血酸、谷胱甘肽、α-生育酚和β-胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)成分最豐富的來源[15]。該試驗(yàn)也證明其對(duì)大腸桿菌有較好的抑制作用，在食品、制藥業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用潛能較大。

表3 不同濃度馬齒莧提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果

試驗(yàn)以蒸餾水為萃取試劑，以對(duì)大腸桿菌的抑制活性為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)法優(yōu)化了馬齒莧的提取工藝，獲得最佳提取工藝條件為：微波功率800 W，萃取時(shí)間9 m in，萃取溫度50℃，料液比1︰50。在此條件下，馬齒莧提取物得率為15.94%，高于紀(jì)麗麗等[16-17]獲得的馬齒莧多糖提取率（11.74%）和馬齒莧總黃酮化合物提取率（11.35%）。這表明該工藝提高了馬齒莧中活性物質(zhì)的提取率，且操作簡(jiǎn)便效率高，是理想的提取工藝。

對(duì)細(xì)菌的抑制活性測(cè)定結(jié)果表明，馬齒莧對(duì)沙門氏菌和枯草桿菌無抑制作用，但對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用，最小抑制濃度（M IC）分別為6.25 和1.56 mg/m L，對(duì)大腸桿菌的抑制效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。

上述研究結(jié)果可為合理開發(fā)利用植物資源，提高馬齒莧的附加值以及馬齒莧中抑制細(xì)菌物質(zhì)的分離純化提供一定參考。

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