植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆及原核表達

時粲等

摘要：根據GenBank中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）基因組序列設計引物，利用PCR技術擴增了植物乳桿菌QL-14的谷氨酸脫羧酶編碼基因gadB，克隆至表達載體pGEX-4T-3，轉化大腸桿菌（Escherichia coli）后進行原核表達，對表達條件進行了優化并對表達蛋白質進了純化。結果表明，擴增目的gadB基因的開放閱讀框（ORF）全長1 407 bp，編碼469個氨基酸，氨基酸序列與植物乳桿菌WCFS1同源性為99.6%。通過優化誘導表達條件，得到純化蛋白質GAD大小為53.6 ku，等電點為5.58，比活力為9.9 U/mg。

關鍵詞：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；γ-氨基丁酸；谷氨酸脫羧酶；原核表達；GST標簽蛋白質

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4328-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.058

γ-氨基丁酸（GABA）作為一種非蛋白質氨基酸，是目前研究較為深入的哺乳動物腦組織的一種重要的抑制性神經遞質[1]，具有一系列的生理功能，例如可降血壓[2]、治療癲癇[3]、抗疲勞[4]、提高免疫力[5]等。谷氨酸脫羧酶（GAD）是生物體內催化L-谷氨酸經α-脫羧為GABA的限速酶[6]。

目前，國內外主要采用化學合成法、植物富集法和微生物法制備GABA?；瘜W合成法反應條件劇烈，污染嚴重，不適合食品添加[7]；植物富集法提取的GABA含量較低，提取較為困難[8]；微生物發酵法條件溫和、安全、成本較低，但后處理過程復雜且生產周期長[9]。通過基因工程技術克隆高活性的GAD進行體外催化是獲得大量GABA的潛在技術手段[10，11]。本研究通過克隆植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）QL-14中gadB基因并在大腸桿菌（Escherichia coli）中進行原核表達，借助大腸桿菌生長迅速、易于培養及融合表達質粒pGEX-4T-3可人工調控表達的優點進行高效表達，同時對其進行純化以期獲得有較高活性的GAD，為今后將GAD應用于GABA生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 大腸桿菌BL21、植物乳桿菌QL-14和質粒pGEX-4T-3由廣西科技大學生物與化學工程學院提供。

1.1.2 試劑 PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ以及TA克隆試劑盒購自TaKaRa公司，質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，低分子質量蛋白質Marker、氨芐青霉素（AMP）、IPTG購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank中發表的植物乳桿菌WCFS1全基因序列（登錄號：NC004567），針對其gadB基因用Primer Premier5.0設計1對特異性引物lpgadbs/lpgadba，同時，根據融合表達載體pGEX-4T-3上多克隆位點的特征，在兩條引物5′端分別插入限制性內切酶位點（下劃線部分），由上海英俊生物工程有限公司合成。引物序列lpgadbs：5′-GGATCCATGGCAATGTTATACGGTA-3′；lpgadba：5′-GAATTCTCAGTGTGTGAATCCGT-3′。

1.2.2 gadB基因的克隆 以植物乳桿菌QL-14菌液為模版，按如下反應物體系進行PCR反應：0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL），10 μL 5×PrimeSTAR Buffer，4 μL dNTP Mixture（各2.5 mmol/L），2 μL模板（菌液），引物lpgadbs/lpgadba（10 mmol/L）各1 μL，添加ddH2O至50 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收。加20 μL A體系 [13.5 μL 膠回收產物，0.5 μL TaKaRa TaqTM（5 U/μL）， 2 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ free），3 μL dNTP Mixture（各2.5 mmol/L），1 μL MgCl2（25 mmol/L）]，72 ℃反應30 min后與pMD18-T載體在16 ℃連接過夜，連接產物轉化至感受態細胞，在含100 μg/mL AMP的LB平板上進行抗性篩選。挑選單克隆經PCR、雙酶切驗證后送至上海英俊生物工程有限公司測序。

1.2.3 融合表達質粒的構建及鑒定 將質粒pMD18-T-gadB和pGEX-4t-3融合質粒分別經限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，以10∶1的體積比混合后加入T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，將連接產物轉化至感受態細胞，在含100 μL/mL AMP的LB平板上進行抗性篩選。挑選單克隆經PCR、雙酶切驗證后進行測序。

1.2.4 重組蛋白質誘導表達 取新鮮培養的重組菌菌液1.0 mL（含100 μg/mL AMP）接種于100 mL LB液體培養基（含100 μg/mL AMP）上，37 ℃、120 r/min搖床培養至OD600 nm=0.4～0.6時加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）進行誘導表達。誘導完成后取1.0 mL菌液濃縮至150 μL，于12 000 r/min 離心5 min，去上清液后加入2×樣品緩沖液煮沸15 min，然后12 000 r/min離心15 min，取上清液進行10%的SDS-PAGE凝膠電泳。SDS-PAGE凝膠配制及電泳條件參考《蛋白質技術手冊》[12]。endprint

1.2.5 融合蛋白質可溶性分析 將誘導后的菌體懸浮于PBS，利用超聲細胞破碎儀破碎菌體（35 W，工作2 s間歇1 s，10 min）。將破碎后的菌液6 000 r/min離心10 min，分別取上清液和沉淀進行電泳。

1.2.6 GAD的純化 將誘導表達的菌液400 mL于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體，用20 mL PBS緩沖液（pH 7.4）懸浮菌體，超聲波破碎細胞，然后經0.45 μm濾膜過濾后上柱，用GST（谷胱甘肽）瓊脂糖凝膠柱對重組蛋白質進行純化，得到純化后的GST-GAD，通過凝血酶Thrombin將標簽蛋白質GST切除掉，得到目的蛋白質GAD。純化后的蛋白質含量采用Bradford[13]法測定，以BSA（牛血清蛋白質）為標準蛋白質。

1.2.7 GAD活力的測定 采用比色法。配制一定量的底物溶液Macllvaine[14]緩沖體系（0.2 mol/L，pH 4.8，含0.02 mol/L底物L-谷氨酸鈉），取400 μL底物溶液和200 μL酶液在37 ℃反應30 min后煮沸終止反應；再加入1.0 mL 6%（V/V）苯酚和1.0 mL次氯酸鈉溶液，充分振蕩后，沸水浴中反應10 min，迅速在冰浴中冷卻顯色20 min，待出現藍綠色后加入60%乙醇溶液2.0 mL，最后在643.5 nm處測定吸光度。酶反應體系中GABA的量以標準曲線確定，一個酶活力單位（U）定義為在測定條件下每分鐘產生1 μmol GABA所需的酶量。

2 結果與分析

2.1 gadB基因的克隆及表達質粒的構建

gadB基因PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析后可見一段約1 400 bp的特異性條帶（圖1）。測序結果顯示，該片段長1 410 bp，含全長為1 407 bp的開放閱讀框（ORF）編碼序列?？寺〉膅adB基因序列已經提交到GenBank數據庫，登錄號為KJ542619，氨基酸序列登錄號為AHY84727。

pMD-18-gadB與pGEX-4T-3分別經雙酶切后連接，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，在含100 μg/mL AMP的LB平板上進行抗性篩選。挑選單克隆培養后提取重組質粒，以質粒為模板進行PCR及雙酶切驗證，測序結果表明目的基因成功地克隆到融合表達載體pGEX-4T-3中。對測序后的氨基酸序列進行多重序列比對，結果如圖2所示，發現其序列與植物乳桿菌WCFS1的氨基酸序列僅存在兩個氨基酸位點的差異，同源性較高，為99.6%。

2.2 gadB基因重組蛋白質的誘導表達結果

根據“1.2.4”所述，分別從IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度對重組蛋白質的誘導表達條件進行了優化。從SDS-PAGE電泳結果可以看出，在大約79 ku處有明顯條帶，說明融合蛋白質已經得到表達，同時以空載體進行誘導表達作為對照。經過上述優化，確定以IPTG濃度1.0 mmol/L（圖3）、誘導時間5 h（圖4）、誘導溫度34 ℃（圖5）的條件對重組質粒進行誘導表達并對其表達蛋白質進行可溶性分析。

2.3 融合蛋白質可溶性分析結果

由于使用大腸桿菌pGEX-4t-3高效表達系統，在一定的誘導條件下重組蛋白質產生后來不及進行構象化而迅速積累，常形成不可溶的包涵體，這可能影響目的蛋白質功能[15]。為此，本研究對融合蛋白質的可溶性進行了檢測，結果如圖6所示。從圖6可以看出，37 ℃誘導過程中融合蛋白質大多以包涵體的形式存在于沉淀中（圖6a），16 ℃誘導融合蛋白質大多以可溶性的形式存在于上清液中（圖6b）。為了得到大量的可溶性蛋白質，本研究目的蛋白質的純化采用16 ℃過夜誘導表達。

2.4 GAD的純化結果

重組蛋白質通過GST瓊脂糖凝膠柱純化，通過凝血酶切除標簽蛋白質，并經過SDS-PAGE電泳分析，分析結果如圖7所示。由圖7可知，純化的融合蛋白質GST-GAD大小在79 ku左右，標簽蛋白質GST大小約為26 ku，目的蛋白質GAD為53.6 ku，與報道的目標蛋白質大小基本一致[16]。圖7中純化后得到相對單一的條帶，基本確定可以是較純的GAD，經測定，純化后GAD蛋白質含量為0.626 mg/mL，等電點為5.58。

2.5 GAD活力的測定結果

純化的GAD與底物L-谷氨酸鈉在一定條件下反應得到GABA，在643.5 nm處檢測GABA吸光度，后帶入GABA標準曲線。將每分鐘產生1 μmol GABA所需的酶量定義為一個酶活力單位（U），得到目的蛋白質的酶活力。純化后的目的蛋白質GAD有較高的活力，總活力為6.2 U/mL，比活力為9.9 U/mg。

3 結論

通過克隆植物乳桿菌QL-14谷氨酸脫羧酶（共469個氨基酸），發現其與GenBank上已發表的植物乳桿菌L. plantarum WCFS1[17]（GenBank登錄號：YP 0048490915）的GAD氨基酸序列同源性為99.6%，僅在2個位點有差異，說明在不同的植物乳桿菌菌株中的GAD氨基酸序列略有差異。

經過誘導條件優化，發現IPTG的誘導表達條件與蛋白質的表達量息息相關，其中隨著誘導時間的增加表達量增加明顯，在誘導5 h時表達量達到最大值，誘導溫度的升高致使表達量的增加也是很可觀的，而IPTG誘導濃度的增加對目的表達量增加量影響并不大。尹淑琴等[18]采用同樣的表達體系進行原核表達所得的最優條件為IPTG濃度0.3 mmol/L、誘導溫度32 ℃。說明相同的表達體系中不同的基因表達條件不同。重組蛋白質可溶性分析中，發現融合蛋白質GST-GAD在37 ℃高溫誘導條件下易形成不可溶的包涵體，不利于純化，所以選擇在16 ℃下過夜誘導。誘導后蛋白質經GST瓊脂糖凝膠柱純化得到有一定純度的目的蛋白質GAD（大小53.6 ku，等電點5.58），并用凝血酶切除掉標簽蛋白質GST，排除了可能對GAD活性有干擾的因素。通過酶活力測定發現純化蛋白質GAD總活力為6.2 U/mL，比活力為9.9 U/mg，有較高酶活力，具備工業催化生產GABA的潛在條件。endprint

綜合上述，本試驗成功克隆了植物乳桿菌gadB基因，并構建了重組表達菌株，對重組蛋白質的表達條件進行了優化并且得到了有較高活性的目的蛋白質GAD，為后續對GAD性質的進一步研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] ERLANDER M J， TOBIN A J. The structural and functional heterogeneity of glutamic acid decarboxylase：A review[J]. Neurochem Reserch，1991，16（3）：215-226.

[2] DE LA GARZA R， ZORICK T， HEINZERLING K G， et al. The cardiovascular and subjective effects of methamphetamine combined with gamma-vinyl-gamma-aminobutyric acid （GVG） in non-treatment seeking methamphetamine-dependent volunteers[J]. Pharmacology biochemistry and behavior，2009，94（1）：186-193.

[3] PODELL M， HADJICONSTANTINOU M. Cerebrospinal fluid gamma-aminobutyric acid and glutamate values in dogs with epilepsy[J]. American journal of veterinary research，1997，58（5）：451-456.

[4] 茅 原， 杉浦友美.近年のGABA生理機能研究-腦機能改善作用，高血壓作用を中心に[J].食品開發，2001，36（6）：4-6.

[5] PARK K， KIM N， OH C， et al. Effects of lactic acid bacteria cultures with enhanced levels of GABA on immune cell stimulation[J]. The FASEB Journal，2006，20：270-274.

[6] UENO H. Enzymatic and structural aspects on glutamate decarboxylase[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2000，10（1-3）：67-79.

[7] 李良鑄，李明嘩.最新生化藥物制備技術[M].北京：中國醫藥科技出版社，2001.79-80.

[8] 許建軍.γ-氨基丁酸（GABA）——一種新型的功能性食品因子[J].食品工業科技，2003，24（1）：109-110.

[9] CHOI S I，LEE J W，PARK S M，et al.Improvement of γ-aminobutyric acid （GABA） production using cell entrapment of Lactobacillus brevis GABA 057[J]. Microbiol Biotechnol，2006， 16（4）：562-568.

[10] LIN Q，YANG S Y.Cloning and expression of glutamate decarboxylase gene from Streptococcus thermophilus Y2[J].The Journal of General and Applied Microbiology，2009，55（4）： 305-310.

[11] KIM S H，SHIN B H. Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12（6）：707-712.

[12] 汪家政，范 明.蛋白質技術手冊[M].北京：科學出版社，2000. 77-108.

[13] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976， 72（9）：248-254.

[14] 許建軍，江 波，許時嬰.比色法快速測定乳酸菌谷氨酸脫羧酶活力及其應用[J].微生物學通報，2004，31（2）：66-71.

[15] BESSETTE P H，ASLUND F，BECKWITH J，et al. Efficient folding of protein with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm[J]. Proc Nat1 Acad Sci USA，1999， 96（24）：13703-13708.

[16] NOMURA M，NAKAJIMA I，FUJITA Y.Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene[J]. Microbiology， 1999，145（6）：1375-1380.

[17] SIEZEN R J，FRANCKE C，RENCKENS B，et al.Complete resequencing and reannotation of the Lactobacillus plantarum WCFS1 genome[J].J Bacteriol，2012，194（1）：195-196.

[18] 尹淑琴，常 泓，范 艷，等.鈣激活酶激活蛋白基因的克隆及其在原核生物中表達及條件的優化[J].激光生物學報，2012（2）：156-161.endprint