煙曲霉YSITB I菌株篩選及其降解木質纖維中木質素研究

袁俊超等

摘要：天牛幼蟲腸道菌群具有分解木質纖維的功能。本研究以木質纖維為唯一碳源，從天牛幼蟲腸道中篩選出三株對木纖維具有降解能力的菌株，對其中的煙曲霉YSITB I菌株降解木纖維中木質素能力及降解條件進行研究，并對三種菌株降解木纖維中木質素的協同作用進行了初步觀察。結果顯示，煙曲霉YSITB I菌株具有較好的木質素降解作用，在30 ℃、pH值6.8條件下，對構樹木質纖維中木質素的降解率可達56.9%；枯草芽孢桿菌YSITBII和煙曲霉YSITB I協同作用可提高木質素降解效率至64.8%；煙曲霉YSITB I 15d降解木纖維效率高于40%。煙曲霉對木質纖維的降解作用達到甚至高于模式菌-黃包原毛平革菌，降解木纖維程度較高，用于木質纖維脫木質素或秸稈降解漚肥具有很好的應用前景。

關鍵詞：木質素；天牛幼蟲；pH；溫度；協同性；煙曲霉菌；漚肥

中圖分類號：S182 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4164-04

天牛成蟲在樹木表皮上蛀槽或鉆洞產卵，卵孵化出幼蟲后即蛀入樹干，最初在樹皮下取食，待齡期增大后，即鉆入木質部，在樹干內越冬，通常可在樹干內生活3～4個月甚至1～2年，以蛀食木質部為生。其消化腸道是一個復雜的生態系統，棲息著大量的微生物。這些微生物對宿主起著非常重要的作用，其中某些種類可能具有分解木質纖維中的木質素的能力[1-3]。本項目擬從天牛幼蟲腸道菌群中分離篩選具木質素降解功能的菌株，探討其降解木質素作用條件、降解效率以及影響因素，用于木質纖維的再利用脫木質素或廢棄木材和秸稈等的降解[4，5]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料 天牛幼蟲：2014年3月采自湖北咸寧蔡家嶺林場楊樹樹干。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）YSITB I菌株、枯草芽孢桿菌YSITB Ⅱ菌株、蠟樣芽孢桿菌YSITB Ⅲ菌株，由本試驗分離篩選自天牛幼蟲腸道。黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）（CICC14076），由中國工業微生物菌種保存中心提供。木纖維是構樹根提取黃酮后的殘渣，脫脂脫蛋白，低溫烘干，粉碎，淺黃色粉末。

1.1.2 培養基 PDA培養基：牛肉膏蛋白胨培養基。木纖維液體培養基：構樹木纖維0.500 0 g，KH2PO4 0.215 0 g，（NH4）2SO4 0.216 0 g，MgSO4 0.007 3 g，CaCl2 0.015 0 g，加去離子水溶解至50 mL。木纖維固體培養基：在木纖維液體培養基基礎上加入4.5 g瓊脂，加熱融化。每種培養基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 木質素（GR荷蘭DUCHEFA公司）、蒽酮（AR國藥集團化學試劑有限公司）、溴乙酰（AR國藥集團化學試劑有限公司）。紫外分光光度計（上海精密科學有限公司UV759），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71）

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、純化及篩選 取天牛幼蟲一條，以75%的乙醇清洗，顯微鏡下取出腸道，加2 mL無菌水勻漿，梯度稀釋至10-8，分別取10-6、10-7、10-8三個梯度勻漿懸液200 μL涂布于木纖維固體培養基上，每個濃度梯度重復3次。37 ℃培養，隔天觀察。取各種不同單菌落再涂布于木纖維固體培養基上，在同樣條件下進行2次純化培養。選擇生長良好的菌落進行液體培養，觀察各菌落對木質纖維的降解作用。

1.2.2 菌株形態觀察及鑒定 對生長較好的3種主要菌株進行菌落、菌絲及菌細胞觀察，真菌做ITS序列鑒定，細菌做16S序列鑒定。

1.2.3 煙曲霉YSITB I菌株降解木纖維觀察 選取其中生長較好的1種菌株（編號為YSITB I，經鑒定為煙曲霉）作進一步降解木纖維作用觀察。取直徑約5 mm 煙曲霉YSITB I菌落1個，加2 mL滅菌水充分震蕩制成菌懸浮液。每30 mL木纖維液體培養基中接入200 μL菌懸液，橡膠塞塞緊，設為試驗組。另取30 mL木纖維液體培養基，接入200 μL無菌水，作為空白對照組，每組平行接種3瓶，在恒溫空氣搖床30 ℃、100 r/min下培養。觀察記錄菌落生長及木纖維降解情況。

1.2.4 煙曲霉YSITB I菌株降解木質素條件選擇 溫度按1.2.3中試驗方法和用量接種煙曲霉YSITB I，分別在10 ℃（室外）、15 ℃（室內）、30 ℃、40 ℃、50 ℃共5個溫度條件下培養，每隔3 d取出200 μL培養液，用硫酸-蒽酮法[6]檢測溶液還原糖含量，共觀察15 d。最后，培養液過濾、洗滌、烘干，得木纖維殘渣，稱重，用溴乙酰法[7-9]測量木質素含量。以黃孢原毛平革菌作對照進行同樣的培養和處理。按下式計算木質素降解率。

木質素降解率=殘渣中木質素總量/原料中木質素總量×100%

天牛幼蟲腸道液pH約6.5，觀察不同pH對煙曲霉降解木質素的影響。以NaH2PO4-Na2HPO4緩沖系配制木纖維液體培養基，pH分別調為5.9、6.2、6.5、6.8、7.1，按1.2.3中試驗方法和用量接種煙曲霉YSITB I，按以上取樣方法進行檢測。以黃孢原毛平革菌作對照進行同樣的培養和處理。

1.2.5 煙曲霉YSITB I菌株與兩種細菌菌株的協同降解木質素作用 將煙曲霉YSITB I與枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌按下述方式組合，接種至30 mL木纖維液體培養基中，按1.2.3中試驗方法處理培養。按1.2.4.取樣方法進行檢測。組合①，200 μL的煙曲霉YSITB I菌液；組合②，100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+100 μL的枯草芽孢桿菌菌液；組合③，100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+100 μl的蠟樣芽孢桿菌菌液；組合④，100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+50 μL的枯草芽孢桿菌菌液+50 μL的蠟樣芽孢桿菌菌液。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

以木纖維固體培養基從天牛幼蟲腸道中分離篩選出3株長勢良好的菌株（圖1），分別為YSITB I、YSITB II和YSITB III。YSITB I：棉花樣，開始為白色，2～3 d后轉為綠色，數日后變為深綠色，呈粉末狀。YSITB II：圓點狀，乳白色，菌落大小不一，向上凸起。YSITB III：菌落較大，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或蠟狀，邊緣放射狀擴散。圖2a為菌絲在木纖維上的生長情況，菌絲包裹木纖維顆粒生長，基部伸入纖維顆粒內部，第二天開始出現孢子囊，孢子囊呈燒瓶狀，小梗單層，由多列菌絲排列成柵欄狀，頂端有鏈形分生孢子，分生孢子球形，有小棘，呈綠色，如圖2b所示。經ITS序列鑒定，YSITB I為煙曲霉，YSITBⅡ和Ⅱ和YSITBⅢ經16S序列鑒定，分別為枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。圖3是煙曲霉YSITB I的進化樹。

2.2 煙曲霉YSITB I降解木纖維觀察

圖4a示煙曲霉YSITB I在木纖維液體培養基生長形成的菌絲團，培養至第二天時菌絲團直徑可達6 cm，纖維顆粒被菌絲包裹，溶液變得澄清透明，基本見不到明顯的木纖維顆粒；空白木纖維培養基在整個培養過程中無明顯變化，如圖4b。

2.3 煙曲霉YSITB I在不同條件下對木纖維的降解作用

2.3.1 溫度的影響 由表1可知，在考察的溫度范圍內，煙曲霉YSITB I對木纖維中木質素的降解率先隨溫度升高而增大，30 ℃時達到最大降解率45.1%，隨后隨溫度升高降解作用減小。黃孢原毛平革菌在溫度為15 ℃時，木質素的最大降解率為39.2%，煙曲霉YSITB I對木質素的最大降解率比黃孢原毛平革菌高出5.9個百分點。

對纖維素的降解作用以培養液中還原糖的變化表示，如圖5所示。溫度在30 ℃和40 ℃時，培養液中還原糖的含量較低，這應是兩種作用的共同結果，一方面菌株生長過程中分泌的酶降解纖維素和半纖維素等物質使糖含量不斷升高，另一方面菌株生長不斷消耗糖，其一階段糖的生產量高于糖的消耗量，培養液中糖含量不斷增加，至第九天二者達到平衡，之后隨著菌株不斷生長，糖消耗量超過糖的生產量，培養液中糖含量下降。50 ℃時培養液中還原糖含量隨時間逐漸下降，這可能提示較高溫時，酶活性下降。低溫時糖含量變化沒有明顯趨勢。

2.3.2 pH的影響 由表2可知，煙曲霉YSITB I在pH 6.8時，木質素降解率最大，達56.9%，接近黃孢原毛平革菌的最大降解率60.3%，其他pH條件下，木質素降解效率相差不明顯。培養液中還原糖含量的變化如圖6所示，總體上呈現出先升高后下降的趨勢，至第九天達最大值，其中pH 6.8和pH 7.1時，還原糖含量較低，明顯低于其它pH條件下的含量。

2.4 不同菌株對木質素的協同降解作用

由表4可知，煙曲霉YSITB I+枯草芽孢桿菌協同降解木質素的效率達64.8%，比煙曲霉YSITB I單獨降解木質素效率高出18.6個百分點，也明顯高于其他兩種組合的降解率，說明煙曲霉YSITB I與枯草芽孢桿菌組合對木質素的降解具有一定的協同性。但這種作用需要做進一步觀察研究。煙曲霉YSITB I+蠟樣芽孢桿菌協同降解對含菌絲體木纖維的降解率為41.0%，比煙曲霉YSITB I單獨降解木質纖維高出1個百分點，也明顯高于其他兩種組合的降解率。說明煙曲霉YSITB I與蠟樣芽孢桿菌對木纖維的降解具有一定的協同性。但這種協同作用是否與應用漚肥有關，有待進一步的研究。

3 討論

本試驗篩選出的煙曲霉是天牛幼蟲腸道微生物菌群之一。煙曲霉是一種腐生真菌，是人類肺部的主要真菌病原體[10]。近來，許多微生物學家和環保學家正在研究利用煙曲霉對色素的降解作用和利用煙曲霉菌絲的吸附作用[11]治理污水。霉菌能降解色素、石油等有機物污染物主要是因為分泌的酶[12，13]的作用。黃孢原毛平革菌是降解木質素的模式菌，但近些年來被用作降解色素[14]。煙曲霉也含有降解色素的酶，煙曲霉曾被用作降解植物細胞壁[15]，細胞壁含有豐富的木質素[2]。綜上所述，煙曲霉能降解木質素具有一定的依據。

溫度和pH條件是菌種生長的不可缺少的因素。本試驗通過對煙曲霉木質素降解率的測定，得出了30 ℃為煙曲霉的最適溫度，6.8 pH為最適酸堿度，符合普遍真菌的生長溫度和pH值。

4 結論

為尋找木質素降解菌，本研究從天牛幼蟲腸道中分離出3種可利用木纖維作碳源的菌株，其中煙曲霉YSITB I具有明顯的降解木質素作用，在pH 6.8、溫度30 ℃條件下，對木纖維中木質素的降解率可達56.9%。煙曲霉+枯草芽孢桿菌的協同降解木質素作用要好于煙曲霉單獨對木質素的降解作用，其降解木質素效率要高出18.6個百分點；煙曲霉YSITB I+蠟樣芽孢桿菌協同降解木纖維的效率達41.0%。通過煙曲霉和黃孢原毛平革菌降解木質素兩個因素的影響下的陽性對照，在誤差允許的范圍內，煙曲霉對木質素的降解作用和黃孢原毛平革菌的基本持平。所以煙曲霉用于木質纖維脫木質素或秸稈降解漚肥具有很好的應用前景。

參考文獻：

[1] 王小藝，楊忠岐，唐艷龍，等.栗山天牛幼蟲齡數和齡期的測定[J].昆蟲學報，2012，55（5）：575-584.

[2] 王玉榮，邢欣婷，任海青，等.紫外顯微分光光度法測定杉木枝條木質素微區分布[J].光譜學與光譜分析，2012，32（6）：1685-1688.

[3] 陳金華，王中康，賀 閔，等.DGGE和RFLP方法分析桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物多樣性[J].生物技術通報，2008（6）：115-120.

[4] 黃 慧，申源源，陳 宏.黃孢原毛平革菌對玉米秸稈木質素的降解研究[J].西南大學學報，2011，33（7）：93-97.

[5] 李亞軍，張英杰，鄭紅磊，等.農業秸稈微生物降解的技術研究進展[J].山東化工，2015，4（44）：38-40.

[6] 位 杰，吳翠云，蔣 媛，等.蒽酮法測定紅棗可溶性糖含量條件的優化[J].食品科學，2014，（35）24：136-140.

[7] 王建慶，曹佃元，張 玉.乙溴酰法測定棉籽殼中木質素的含量[J].紡織學報，2013（9）：42-44.

[8] TAPPI TestMethod T222om-88，“Acid-insoluble lignin in wood and pulp”，TAPPI Press，Atlanta，GA.

[9] JOHNSON D B，MOORE W E，ZANK L C.The spectrophotometric determination of lignin in smallwood samples[J].Tappi，1961，44（11）：793.

[10] HELIOSWILTQN S C， LUDMILLA T，CRISTINA R B C，et al.The Immune Interplay between the Host and the Pathogen in Aspergillus fumigatus Lung Infection[J]. BioMed Research International， 2013：1-14.

[11] BASKAR G， PAVITHRA S K， FAHAD K S， et al. Optimization， equilibrium， kinetic modeling， and thermodynamic studies of biosorption of aniline blue by the dead biomass of Aspergillus fumigatus[J]. Desalination and Water Treatment， 2014，52（19-21）：3547-3554.

[12] 何小慧.黃曲霉A5p1脫色類黑精及其機理初探[C].南寧：廣西大學，2014.

[13] 陳輝倫.石油污染淺層含水層的微生物修復研究進展[J].安全與環境工程，2015，22（1）：66-72.

[14] 司靜.白腐真菌絨毛栓孔對偶氮染料剛果紅脫色的研究[C].北京林業大學森林保護學博士論文.2014.

[15] JALIS H，AHMAP A，KHAN S A， et al.Utilization of apple peels for the production of plant cell-wall degrading enzymes by aspergillus fumigatus MS16[J]. Journal of Animal & Plant Sciences， 2014，24（2）：664-667.