煙草黑脛病菌侵染葉片的動態

姚恒++方敦煌++肖炳光

摘要：對抗煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）的煙草品種RBST與紅花大金元（紅大）葉片進行黑脛菌接種，采用細胞生物學的方法，在不同時間取樣、染色、顯微觀察，揭示黑脛病菌在抗感葉片時的侵染動態。結果表明，接種感病紅大葉片16～20 h，黑脛病菌通過氣孔侵入紅大葉表皮組織，接種48 h后，黑脛病菌長滿整個接種小葉盤；而接種抗病RBST葉片24 h后，抗病的RBST葉片才出現極少的壞死斑，隨著接種時間的延長，壞死斑區域有少量的擴大，但在接種72 h后，壞死面積只占接種小葉盤面積的很小部分。

關鍵詞：煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）； 侵染； 動態

中圖分類號：S432.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4184-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.019

煙草黑脛病的病原為卵菌門疫霉屬煙草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda de Haan），嚴重危害世界各煙區的煙草生產[1-3]，其不僅侵染煙草成株的莖基部和根部，也侵染葉片和莖中、上部[4-6]。中國主要煙區的煙草黑脛病菌為0號和1號小種[7]。

煙草黑脛病的防治目前主要采用選育抗病品種、輪作和藥劑防治等措施，選育抗病品種是最直接最有效的方法。目前，我國也已選育并且從國外引進抗黑脛病的烤煙品種[8-10]。除此之外，改進某些栽培措施[11，12]和利用拮抗菌[13-15]的生物防治也能對煙草黑脛病的發生取得一定的效果。

煙草黑脛病的研究文獻雖然很多，但是對黑脛病菌是如何侵染煙草葉片的文獻很少。本研究以感病和抗病的2個品種進行試驗，研究了煙草黑脛病菌侵染葉片的動態過程，揭示了病菌是何時侵染感病煙草葉片、何時在葉表皮組織中擴展，比較了黑脛病菌對感病、抗病煙草葉片侵染的不同。旨在探討煙草黑脛病侵染葉片的規律，為煙草黑脛病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種：感煙草黑脛病品種紅花大金元，抗煙草黑脛病品種RBST。煙草黑脛病菌為煙草疫霉菌株119#。培養基為燕麥培養基（OA）：燕麥30 g、瓊脂15 g、去離子水1 L。稱取新鮮燕麥片30 g，用沙布包起燕麥片扎口加入到1 L去離子水中煮沸2 h，取出沙布將液體補足1 L，加入瓊脂15 g，121.3 ℃高壓15 min分裝待用。

1.2 方法

1.2.1 煙草幼苗的培養 采用二段式育苗方法：將供試煙草品種的種子播種在595孔的漂浮盤上，在12 h光照與12 h黑暗交替、溫度28±1 ℃、濕度70%以上的人工培養室中培養至煙苗可以連同基質一起拔出時，轉移到162孔漂浮盤中在上述人工培養室繼續培養至6～7葉期（苗齡40～50 d）。

1.2.2 煙苗接種疫霉病菌 離體葉片接種：分別剪取煙株自上而下的第3片，放置于墊有3層濾紙的培養皿中，利用直徑0.5 cm打孔器將培養基上的黑脛病的菌絲塊打成圓柱塊狀，用小鑷子取菌絲塊黏附在葉片上進行侵染。

1.2.3 取樣 按照表1時間間隔取樣，臨近每個時間點，利用直徑0.5 cm打孔器將菌絲塊侵染部位的小葉盤取下。

1.2.4 染色 臺盼藍/苯胺藍染色 菌絲結構和植物死亡組織細胞被染成藍色。儲存液：10 g苯酚、10 mL甘油、10 mL乳酸、10 mL ddH2O、0.02 g臺盼藍/苯胺藍。工作液∶儲存液∶96%乙醇（1∶2，V/V）。透明液∶1 kg 水合氯醛溶解于400 mL去離子水，蓋好蓋子溶解12 h。染色步驟：取下菌絲塊侵染的葉片組織浸沒到臺盼藍/苯胺藍工作液中，沸水水浴1 min，工作液染色過夜。第2天取出染色葉片放入水合氯醛中透明，根據需要可換幾次透明液，直到樣品變成透明后就可以進行鏡檢。

2 結果與分析

2.1 煙草黑脛病菌從氣孔侵入感病煙草葉表皮

如圖1-a所示，可以清晰的看到煙草黑脛病疫霉菌侵染紅大葉表皮是通過氣孔侵入的。查詢樣本取樣時間，確定圖1-a為疫霉菌接種16 h的樣品，這說明通過病菌塊接種煙草葉片，疫霉病菌需要經過16 h才能開始從煙草氣孔侵入葉表皮中；圖1-b為菌絲塊接種20 h后的樣品圖像，在低倍物鏡下，可以清晰的觀察到大量疫霉病菌從葉表皮細胞氣孔中侵入葉表皮組織。

通過細胞學染色觀察，可以清楚地知道，煙草黑脛病疫霉病菌開始侵入葉片大約需要16～20 h。

2.2 煙草疫霉菌侵染紅大煙草葉表皮的動態

如圖2所示，在接種疫霉菌16 h后，黑脛病疫霉菌開始侵染紅大葉表皮；20～24 h疫霉病菌絲就能夠長入葉片葉肉組織；30～48 h菌絲數量逐漸增多，48 h就能長滿整個樣品小葉盤；56～72 h菌絲生長密度進一步增大，對煙葉危害加劇。

比較黑脛病疫霉菌侵染感病煙草紅大葉片的樣品細胞學圖片，可以將黑脛病疫霉病菌侵染葉表皮組織分為4個階段：首先為黑脛病預備侵染階段，這個階段為0～16 h。這個階段黑脛病的菌絲還不能侵入煙草葉表皮，如果要預防黑脛病菌對煙葉的危害，在這個時期效果最佳。其次是開始侵染階段，這個階段大約是在接種后16～24 h，這個階段黑脛病菌已經開始從葉表皮的氣孔侵入到葉肉組織內，但是疫霉菌絲侵染的程度還比較輕，這個時期進行噴藥控制應該還有效果。再次就是24～48 h，這個時期，黑脛病菌絲已經在煙葉內部進行生長，危害進一步加劇。最后一個時期48～72 h為重度感染時期，黑脛病菌絲已經長滿整個接種小葉盤，這時期再進行防治已經失去了意義。

2.3 RBST煙草抗疫霉菌侵染的動態

如圖3所示，在接種疫霉菌24 h后，RBST葉片表面出現極個別壞死小點；接種36～48 h，RBST葉片表面會出現個別的侵染部位，但是區域很小；接種56～72 h，RBST葉面出現少量壞死斑，但是在低倍視野下進一步觀察，這部分壞死區域只占接種葉盤面積的很少量的部分。總之，在接種72 h后，壞死的葉盤面積仍然是占很小的部分。結果表明，RBST煙草品種的葉片對黑脛病疫霉菌是高度拮抗的。

3 小結與討論

不同煙草品種葉片對黑脛病疫霉菌的抗性有著顯著的差異，煙葉拮抗黑脛病疫霉菌侵染能力與煙草品種自身黑脛病的抗性強弱呈正相關。常規鑒定煙草品種黑脛病菌抗性的方法是通過莖部注射接種的方法進行的，然后統計煙草莖部病情指數及發病率來評定煙草品種的抗性級別。這種鑒定方法的人工操作成本太高，并且受到煙草生長狀況的限制。從煙葉表皮細胞圖片可以看出，不同品種煙葉在接種黑脛病菌后，煙葉表皮對黑脛病菌的侵染呈現相應的抗感狀況，并且抗感病情的發展情況和接種時間呈現一定程度的正相關性。如感病的紅大隨著接種黑脛病菌時間的延長，黑脛病菌在煙葉葉肉組織中的生長數量增加，病情加劇，而抗病的RBST煙草表皮壞死程度也在緩慢增加，表明這種接種黑脛病菌的方法是能夠真實、有效地反映煙草黑脛病抗性的。接種黑脛病菌為煙草黑脛病的抗性鑒定提供一個便利且高效的方法，客觀上也將促進煙草抗黑脛病品種的選育。

煙草黑脛病的抗性機理有待于深入的研究。本試驗清楚地表明，黑脛病菌是通過氣孔侵入紅大煙草葉表皮組織的。而黑脛病菌卻很少能夠通過RBST的氣孔進入到葉表皮組織中；即使黑脛病菌侵染了RBST的葉表皮，RBST又是通過何種機制來拮抗黑脛病菌在其中的繁殖和生長的。雖然大量的生理學證據表明在寄主植物和病原物非親和性互作（抗病反應）和親和性互作（感病反應）中酶與植物抗性密切相關[16-18]。植物體內SOD、POD、CAT、PPO、PAL和丙二醛可以作為植物抗病性的生理指標，但是這些指標并不能從根本上揭示煙草黑脛病的抗性機理。只有從基因水平上克隆黑脛病菌抗性相關的基因，并深入的研究抗性基因的功能才能深刻地闡明黑脛病的抗性機理，進而推動煙草抗黑脛病品種的選育。

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