不同處理對金銀花種子萌發及解剖結構的影響

劉恒++蔣向輝

摘要：采用不同濃度的赤霉素、低溫層積、溫水浸泡等方法對金銀花（Lonicera japonica Thunb.）種子進行處理，并測定其發芽率，同時采用石蠟切片法觀察經沙藏處理后的種子解剖結構的變化。結果表明，金銀花種子經100 mg/L的赤霉素處理12 h后發芽率最高；金銀花種子經20 ℃沙藏40 d后發芽率最高；40 ℃以上溫水處理對金銀花種子有不同程度的損害，25 ℃清水浸泡對金銀花種子發芽有一定的促進作用；在低溫層積過程中，金銀花種子逐漸完成后熟過程，胚細胞中逐漸積累多糖顆粒，同時隨著層積時間的延長，種子薄壁細胞逐漸增大，種皮解體，胚乳中的營養成分逐步分解，提供種子萌發所需要的物質與能量，而高溫層積對胚的發育表現出明顯的抑制作用。

關鍵詞：金銀花（Lonicera japonica Thunb.）種子；萌發；解剖結構

中圖分類號：S567.7+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4221-04

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）又名忍冬，為忍冬科忍冬屬（Lonicera）植物，在中國主產于山東、河北、河南、貴州、湖南、四川等省。金銀花具有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、降血脂、免疫調節等作用，常用于治療癰腫疔瘡、熱血毒痢、風熱感冒與瘟病發熱等癥[1]。金銀花是很多消炎解毒藥的主要原料，中醫處方有約三分之一要用到金銀花，目前以金銀花為原料的中成藥已達200多種，而且隨著以金銀花為主要原料的飲料、保健品和日用化工品的開發，金銀花的經濟價值更加凸顯。

目前，關于金銀花的研究主要集中化學成分及藥理研究方面[2，3]。金銀花種子屬于深休眠類型，在自然條件下，需要越冬才能萌發[4]。金銀花種子在自然條件下絕大部分將被菌類侵襲、動物捕食與破壞以及其他物理、化學因素破壞，導致其種子質量差、后熟時間長，對其有性生殖過程造成了嚴重的影響。至今為止，對解除金銀花種子休眠方法的研究已有報道[5]，但對其休眠機理、休眠解除機制以及萌發過程中解剖結構變化等方面的研究仍缺乏系統的資料。本研究采用不同的方法對金銀花種子進行誘導萌發處理，對有效打破金銀花種子休眠的方法進行了探索，同時對種子萌發過程中形態特征及物質消化情況的變化進行了比較研究，以期為深入揭示金銀花種子休眠形成的機理和解除休眠的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

金銀花種子采自山東省蒼山縣巨花一號金銀花種植基地，種子黑色、長橢圓形，寬度0.16～0.22 cm、長度0.25～0.32 cm，千粒重15.7±0.44 g，含水量6.7%。

1.2 試驗方法

1.2.1 回濕處理 在萌發試驗前參照鄭光華[6]的方法，采用逐級回濕平衡水分法進行回濕處理。

1.2.2 赤霉素處理 50、100、200 mg/L的赤霉素各處理6、12、18 h。以未經任何處理的種子作為對照（CK1），每組50粒種子，記錄發芽的種子數。

1.2.3 沙藏處理 10、20、30 ℃各沙藏10、20、30 d。室溫（25 ℃）下的種子作為對照（CK2），每組50粒種子，記錄發芽的種子數。

1.2.4 溫水處理 40、60、80 ℃的水各處理2、4、6 h，并用室溫（25 ℃）清水浸泡的種子作為對照（CK3），每組50粒種子，記錄發芽的種子數。

1.2.5 發芽率的統計 經不同處理后的種子，置于裝有濾紙（保濕）的培養皿中，以胚根長度大于2 mm的統計為萌發，15 d統計結束。發芽率=（發芽種子數/測定種子數）×100%。試驗結果采用SPSS 13.0軟件進行分析，用t檢驗分析差異顯著性，用Levene Test方法檢驗數據的方差齊性，用單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較（Duncan）方法比較不同數據組間的差異。

1.2.6 石蠟切片 取經不同溫度沙藏處理后的金銀花種子，除去種皮，用FAA固定液浸漬種子24 h，用自來水洗去固定液，用愛氏蘇木精染液進行染色24 h，水洗至不見浮色，加2%氨水處理20 min，再水洗，采用乙醇梯度脫水，用乙醇與二甲苯（1∶1）混合液脫去乙醇。將上述種子浸入純石蠟中，通過在40 ℃溫箱中過夜進行浸蠟，然后進行包埋，干燥2～3 d后進行切片。將黏液涂于洗凈的載玻片上，把切好的薄片貼在上面，40 ℃溫箱中烤片，用二甲苯進行脫蠟，涂上中性樹膠，蓋好蓋玻片，在10×10倍熒光顯微鏡下觀察并攝影。

2 結果與分析

2.1 不同濃度赤霉素對金銀花種子發芽率的影響

赤霉素是廣譜型植物生長調節劑，對于種子內含有抑制物質或缺乏內源促進物質的種子有重要的生長調節作用。從圖1可知，采用赤霉素處理的金銀花種子發芽率有很大的提高，其種子發芽率最高可達44%。100 mg/L與200 mg/L赤霉素處理差異不大，但100 mg/L與50 mg/L的赤霉素處理差異顯著，表明最適合金銀花種子發芽的赤霉素濃度在100～200 mg/L之間。傅強等[7]研究認為，用赤霉素浸種在一定程度上可以調節種子內的激素平衡，促進生長類激素含量增加，從而打破種子休眠。但是隨著赤霉素濃度的升高，處理時間的延長，發芽率也呈現一定的下降趨勢，這也說明了高濃度的赤霉素對金銀花種子萌發有一定的抑制作用。因此，誘導金銀花種子萌發時，赤霉素濃度以采用100 mg/L處理12 h較為合適。

2.2 不同沙藏溫度對金銀花種子發芽率的影響

低溫層積處理是通過構建低溫、濕潤、通氣等條件來解除種子休眠的常用方法。本研究通過金銀花種子與濕沙混合，對金銀花種子進行不同溫度與不同時間的低溫層積處理，從圖2可知，10 ℃低溫短時間層積處理對種子萌發的誘導作用不明顯，甚至發芽率比對照還要低，但經低溫長時間沙藏處理的種子發芽率比未經沙藏處理的種子發芽率明顯要高，尤其在沙藏溫度為20 ℃，處理40 d后發芽率最高，表明這一條件下能最有效地解除金銀花種子的休眠。隨著沙藏溫度的升高，金銀花種子的發芽率降低，表明高溫環境不利于金銀花種子的萌發。已有多項研究表明，種子的低溫層積可導致種子吸水能力加強、細胞滲透性提高、不溶物轉化為可溶物。裴東等[8]研究認為，層積催芽能促使種子合成GA和細胞分裂素等生長激素，降解或轉化ABA等抑制激素。本研究結果顯示，低溫層積與GA的合成與利用之間存在一定的相關性，相關性大小及相關機理有待進一步研究。

2.3 不同水溫度對金銀花種子發芽率的影響

從圖3可知，40 ℃以上的水對金銀花種子有不同程度的損害，而且隨著時間的延長和水溫的升高，損害越來越大，40 ℃水處理6 h以后，種子發芽率在5%以下，水溫為60 ℃時，金銀花種子活力基本喪失。本研究另外通過對比試驗發現，用室溫（25 ℃）清水處理的種子發芽率比未經任何處理的要高很多，這可能與清水浸泡能有效增加種子的含水量有關，種子含水量增加能有效促進種子的生理代謝，縮短休眠時間，從而提高發芽率。

2.4 不同沙藏處理對金銀花種子胚解剖結構的影響

由圖4可以看出，金銀花種子種皮較厚，由3～4層細胞構成，胚乳發達，胚較小。金銀花種子在10 ℃沙藏處理前期，胚乳細胞與外層薄壁細胞排列緊密，隨著低溫處理時間的延長，胚乳細胞與薄壁細胞出現膨大、變形、細胞間分界不清的現象，淀粉粒分布散亂，細胞變形破裂，表明胚的萌動能力逐漸增強。在20 ℃沙藏處理前期，胚的淀粉粒均為單粒卵圓形，分布均勻，體積大小基本一致。隨著處理時間的延長，淀粉粒形態分化較大，分布散亂，胚內部細胞染色明顯增強，內部結構分化明顯，蘇木精染液是生物活性染色劑，染色效果的增強表明沙藏增強了金銀花種子內部組織活性，結果表明，金銀花種子具有一定的生理后熟作用，需在低溫濕潤條件下貯存一段時間后才能順利萌發。從圖4還可以看出，20 ℃沙藏40 d后的種子與其他處理的種子相比，胚分化明顯提前，能有效加劇金銀花種子淀粉粒的消耗和提高胚的活力。30 ℃沙藏處理20 d后胚根能正常分化，40 d后胚根逐步形成，但30 ℃沙藏60 d后胚根逐步失去活性，生長停止。從圖4中還可以看到，近胚根端的胚乳細胞的細胞壁先降解，而近子葉端的胚乳細胞中細胞壁降解相對滯后，由此可以判斷近胚根端的胚乳細胞比近子葉端的胚乳細胞的生命活動更加旺盛。

3 小結與討論

3.1 影響金銀花種子活力及細胞完整性的因素

植物種子的活力與種子細胞結構的完整性緊密相關，種子在采收、貯藏與催芽過程中，如造成細胞膜的損傷、細胞器的畸變等都將導致種子活力的變化[9]。本試驗發現金銀花種子的種皮細胞外有層厚厚的脂質層，而脂質層的疏水特性決定種子不易受到水分影響而難于吸水萌發。隨著水溫升高，能加快脂質層的溶解，種皮向外形成突起，導到種皮與胚之間出現空隙，這些都可以提高種胚的活力，促進種子的萌發。但隨著水溫的進一步升高，導致種子含水量下降、胚軸內部細胞出現變形及結構發生破壞、淀粉粒破裂，加劇了種子內部維管束組織和薄壁細胞活性的喪失，對外部細胞及種皮也產生不良的影響，趙鵬等[10，11]研究認為，這種不良影響主要表現為種子相對電導率的上升，正是由于種子內部細胞活性的喪失和結構完整性的破壞導致了種子活力的下降。

3.2 淀粉粒活性和數量的變化對金銀花種子活力的影響

淀粉粒作為細胞主要能量和碳架貯藏庫，其數量、形態的變化和活性的喪失，能夠反映植物生長發育的能量變化情況[12]。程紅焱等[13]研究發現，淀粉粒數量的減少、淀粉粒的變形破裂以及活性的喪失加速了種子細胞的老化劣變，影響種子活力。本試驗研究表明濕水處理和沙藏處理中，隨貯藏溫度的升高，金銀花種子細胞內的淀粉粒數量減少、活性逐漸喪失，萌發種子的胚根長變短，尤其在50 ℃水處理和30 ℃沙藏后處理后，種子細胞內淀粉粒數量顯著減少，萌發試驗中不具萌發力的種子增多且出現腐爛現象，能夠萌發的種子其萌發后胚根縮短，且伴隨有胚根腐爛的現象，這些都源于種子內部細胞活性的喪失及結構的損傷。金銀花種子在20 ℃以下低溫沙藏處理時，種子發芽率和能量保持能力強，有效地保持種子細胞活性及結構完整性，并且在此溫度下，淀粉粒數量隨溫度升高而呈上升的趨勢。因此，10 ℃或20 ℃沙藏處理能有效促進金銀花種子的萌發，而以20 ℃沙藏處理40 d效果最好。

3.3 胚乳細胞中的脂質小泡的變化對金銀花種子萌發的影響

從圖4可以看出，金銀花種子胚乳中充滿著脂質小泡。這些脂質小泡作為金銀花種子胚乳中的主要貯藏物質，在整個層積過程逐步地分解以提供種子萌發生長所需要的營養物質，而通常種子中的主要儲藏物質是淀粉，是通過淀粉的分解來提供養分。從圖4E可以看出，金銀花種子在層積了40 d后，胚乳細胞中的脂質小泡逐漸降解，液泡開始形成，圖中的黑色粒狀結構可能是脂粒或蛋白質，由于脂粒或蛋白質染色較深，顯微鏡下呈黑色，這個時期蛋白質形成是種子萌發生長的明顯標志。金銀花種子層積60 d后，淀粉進一步地分解，由大顆粒分解為小顆粒，脂粒也出現分解的現象，這主要是由于種子的生理活動需要更多的養分供應，要求胚乳中的營養物質不斷地分解為容易運輸和吸收的小分子的物質，正是胚乳細胞地脂質小泡的解體，提供了種子進一步代謝活動所需要的營養。

植物種子萌發時，一般是胚根的分生細胞先分裂、伸長，在土壤中形成根，然后下胚軸伸長，將胚芽推出地面，長成幼苗[14]，金銀花種子的萌發過程與此基本一致，在這處過程中，低溫層積條件對金銀花種子萌發有至關重要的意義，層積開始時細胞質膜逐漸分解、脂質小泡分解形成液泡、大的淀粉顆粒逐步分解為小的個體等，這些都表明在低溫層積過程中金銀花胚乳中營養物質不斷地分解以提供種子萌發生長所必需的養分。因此，研究胚乳內含物的變化情況可以弄清金銀花種子萌發的進程，從而找到有效打破金銀花種子休眠的方法。

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