巨菌草單寧成分的提取和測定

謝焰鋒等

摘要：以生長1、2、3個月的巨菌草（Pennisetum sinese）葉片為材料，探討巨菌草葉片單寧成分的提取方法和含量，單寧提取方法采用正交試驗進行優化，單寧含量采用福林酚-比色法進行測定。結果表明，巨菌草單寧最佳提取條件為丙酮體積分數70%，提取溫度50 ℃，提取時間1 h。生長1、2、3個月的巨菌草葉片的單寧含量分別為8.47、10.44和12.59 mg/g，與其他牧草相比處于中間水平，且單寧含量隨生長時間的延長而增加，不同生長階段的單寧含量適合不同的動物采食。

關鍵詞：巨菌草（Pennisetum sinese）；牧草；單寧；正交試驗

中圖分類號：S543+.9；TQ943+.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4250-03

巨菌草（Pennisetum sinese）是福建農林大學菌草生物工程技術研究中心從非洲引進的高產、優質菌草，目前在中國福建、寧夏、廣西、浙江、新疆等多個省區和非洲、美洲的許多國家都有推廣種植。巨菌草是禾本科狼尾草屬（Pennisetum）的植物，可以在熱帶、亞熱帶和溫帶生長，是典型的C4植物，對光照和溫度有較高的需求，植株高大，生長快，產量高，抗逆性強[1-3]。巨菌草是多功能草，其用途廣泛，可以以草代木種植菌菇，作為生物材料來生產紙張、纖維板、活性炭等，用作生物質能源發電的原材料，也可用作環境恢復和環境保護的優良植物，此外作為牧草飼養畜禽也是它的一個重要用途[4-9]。巨菌草蛋白質含量高，粗蛋白質含量18.64%，精蛋白質含量16.88%，糖分高，總糖含量8.3%，被稱為“飼草之王”[1]。巨菌草適口性好，葉片柔軟、脆嫩，是牛、馬、羊、豬、兔等家畜，雞、鴨、鵝等家禽和食草性魚喜愛的飼料[1，10]。

單寧通常被認為是牧草中的抗營養因子，一是由于縮合單寧和蛋白質、維生素、金屬離子等絡合，導致這些營養物質不能被動物吸收或者利用效率下降；二是單寧味苦具收斂作用，影響飼料的適口性，導致動物的采食量下降；三是單寧會降低動物對養分的消化率并影響營養物質的吸收。巨菌草作為優質牧草，其營養成分已經有相關報道[1，10]，但是作為抗營養因子的單寧成分的提取工藝和含量測定尚未見報道。為了更全面地了解巨菌草作為牧草的優缺點，對不同生長時期巨菌草葉片中的單寧含量進行了綜合分析，為更好地利用這一資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：供試巨菌草樣品采自湖北省武漢市林業果樹科學研究所武湖基地，不同生長時期的巨菌草葉片采集后陰干，磨粉，儲藏備用。

主要試劑：單寧標準品、福林酚試劑、碳酸鈉、丙酮、去離子水。

主要儀器：i-9型雙光速紫外/可見分光光度計（海能儀器）。

1.2 方法

1.2.1 植物樣品的采集 分別采集生長了1、2、3個月的巨菌草成熟葉片，清洗后自然陰干，磨成粉末備用。

1.2.2 單寧類物質的提取 采用浸提法，以水-有機溶劑混合體系為提取溶劑進行提取。在溶劑提取法中，提取時間、提取溫度和溶劑的選擇是影響單寧提取率的重要因素。本試驗以生長3個月的巨菌草葉片為樣品，以丙酮/水為提取溶劑，以提取時間、提取溫度和丙酮體積分數進行3因素3水平正交試驗（表1），獲得最佳提取方法。采用最佳方法，獲得其他生長時期的巨菌草葉片的提取液，供單寧含量測定。測定時，準確稱取0.5 g樣品，加入4 mL提取溶劑，在設定的溫度和時間下完成提取，轉移出所有提取液，定容到20 mL容量瓶，得到待測溶液。

1.2.3 單寧含量的測定 采用福林酚-比色法測定巨菌草中單寧的含量。標準曲線的制作：精密稱取干燥的單寧酸標準品25 mg，用水定容到50 mL容量瓶中，配制成單寧酸溶液。精密量取單寧酸溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 mL分別置于25 mL容量瓶中，加水定容。精密量取各濃度溶液0.5 mL，分別置于10 mL試管中，先加入2.5 mL 10倍福林酚稀釋溶液，再加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻，靜置30 min后，在760 nm處測定吸光度，并以吸光度為縱坐標，以質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

提取液單寧含量測定：精密量取0.5 mL待測溶液，按照標準曲線的試驗方法操作，在760 nm相同條件下測定吸光度，帶入回歸方程計算出巨菌草葉片中單寧質量濃度，再按公式計算出總單寧含量。其計算公式為：單寧含量（mg/g）=提取液單寧質量濃度×20/原料質量。

1.3 數據處理與統計分析

每個試驗組設3個重復，按照正交試驗得出的最優方法進行提取，提取液按照標準曲線的試驗方法操作，單寧含量測定結果采用ANOVA統計檢驗。

2 結果與分析

2.1 單寧酸標準曲線和方程

以吸光度（y）為縱坐標，單寧酸質量濃度（x）為橫坐標，繪制單寧酸標準曲線，并得出其回歸方程和回歸系數（圖1）。回歸方程為：y=9.554 1x+0.028 6，回歸系數R2=0.997 9，線性范圍為0.02～0.22 mg/mL。

2.2 巨菌草單寧含量正交試驗結果

由正交試驗結果（表2）可知，因素A（丙酮體積分數）、因素B（提取溫度）和因素C（提取時間）的極差分別為2.70、2.28、0.60，因此可知，3因素對單寧含量的影響為丙酮體積分數略大于提取溫度，而二者遠大于提取時間。從表2還可以看出，因素A以三水平70%最佳，因素B以三水平50 ℃最佳，因素C以一水平1 h最佳。因此提取單寧的最佳提取方法是70%丙酮在50 ℃下提取1 h。

2.3 不同生長階段巨菌草單寧含量測定

由表3可知，巨菌草葉片單寧含量隨著生長時間呈上升趨勢，生長1、2、3個月的巨菌草葉片的單寧含量分別為8.47、10.44和12.59 mg/g。

3 討論

本研究通過正交試驗優化了巨菌草單寧提取方法，與李學強等[11]對歐李種殼中單寧提取條件相比，各因素對單寧提取的影響程度均為丙酮體積分數>提取溫度>提取時間，對于最佳提取方法，歐李種殼中單寧是用70%丙酮在60 ℃下提取5 h，而本試驗是用70%丙酮在50 ℃下提取1 h，可以看出二者所用最佳丙酮體積分數一致；而提取溫度略有差異，考慮到丙酮的沸點為56.48 ℃，本研究的50 ℃更為合理；最佳提取時間與文獻相比存在差異，考慮到提取時間對得率影響不顯著，提取1 h更為經濟。

研究測定得到巨菌草生長1、2、3個月時葉片的單寧含量分別為8.47、10.44和12.59 mg/g，高于黑麥草（0.9～1.8 mg/g）[12]、紅三葉（1.2 mg/g）[13]、菊苣（1.71 mg/g）[13]，與車前草（14.10 mg/g）[13]、苔草（6.7 mg/g）[14]相當，低于牛角花（46.20 mg/g）[13]、珠芽蓼（120.2 mg/g）[14]、紅豆草（13.42～34.48 mg/g）[15，16]、百脈根（20～110 mg/g）[17]。總體來說，巨菌草單寧含量與其他牧草相比處于中間水平。

單寧含量是影響牧草適口性的重要因素，當牧草干物質中的單寧含量達到1%以上時，會出現苦澀味，降低適口性，當含量高于2%時可能會產生阻食作用[16-18]。對肉豬和禽類，飼料單寧含量以0.5%～1.0%為宜[18]；而對于反芻動物，其對單寧耐受性較高，有研究證實3%或5%以內是有益水平[16，17]。巨菌草適口性好，可用于飼喂牛、羊、豬、兔、鵝、鴨等草食畜禽和草食性魚類。而在生產中一般巨菌草生長1個月較嫩的時候喂養豬、兔和鵝等畜禽，在生長2～3個月時喂養羊、牛等牲畜。本試驗證實巨菌草葉片單寧含量在1個月時為8.47 mg/g，即0.85%，較適合飼養肉豬和禽類，在生長2個月和3個月時分別為10.44和12.59 mg/g，即1.04%和1.26%，較適合飼養反芻動物，其變化規律和巨菌草在生產實踐中的應用相吻合。

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