靈芝多糖相對分子量檢測及其單糖組分分析

葉素丹（浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江　杭州 310018）

靈芝多糖相對分子量檢測及其單糖組分分析

葉素丹
（浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310018）

靈芝多糖具有多種藥理活性，由于其來源廣泛導(dǎo)致其理化特性、分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)差異不均。本文利用蒸發(fā)光散射檢測器的高效液相凝膠滲透色譜（HPGPC-ELSD）對常規(guī)制備過程獲得的一個主要靈芝多糖純化組分GLP進(jìn)行重均分子量分析；同時利用氣相分析了該GLP的單糖組分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該靈芝多糖純化組分GLP的分子量為91.6 kD，單糖組分分別為葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖，其中以葡萄糖和半乳糖為主。本研究為開展科學(xué)、合理的靈芝多糖理化特性的分析方法進(jìn)而開發(fā)靈芝多糖具有重要意義。

壁靈芝多糖；相對分子量；單糖組分；檢測

靈芝為靈芝科靈芝屬真菌，具有極高的營養(yǎng)、保健、醫(yī)療價值，作為一種名貴中藥在我國用于臨床已有悠久的歷史。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明靈芝具有抗腫瘤、提高免疫力、延緩衰老、抗炎癥、降血糖、降血脂等藥效［1-2］。靈芝的多種藥理活性大多和靈芝多糖有關(guān)，靈芝多糖來源于靈芝子實(shí)體或菌絲體中。提取靈芝多糖的原料較多，不同來源的靈芝多糖含量、理化特性、分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)等方面有所差異，且多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多糖結(jié)構(gòu)又與其生物功能密切相關(guān)［3-4］。目前市場上靈芝加工產(chǎn)品較多，其質(zhì)量參差不齊，因此，建立一種科學(xué)、合理的靈芝多糖理化特性的分析方法以及對其功效活性進(jìn)行準(zhǔn)確評價對開發(fā)靈芝多糖具有重要指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及主要儀器

靈芝，產(chǎn)自江西省。Dextran Standard T系列標(biāo)準(zhǔn)品，Pharmacia公司；bradford法蛋白測定試劑盒，碧云天公司；Agilent 1100系列高效液相色譜儀（HPLC），蒸發(fā)光散射檢測器（ALLTECH ELSD 2000ES）ALLTECH公司；TSK-GEL G3000PWXL，TOSOH公司；氣相色譜：GC：6890N（Adgilent，USA）；色譜柱：J&W DB一5MS（30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm df）。其它試劑為國產(chǎn)分析純。梅特勒AL-204分析天平。

1.2靈芝多糖的制備

將靈芝子實(shí)體粉碎，取200 g，沸水煎煮，過濾，Saveg法去蛋白質(zhì)，活性炭脫色，乙醇沉淀，冷凍干燥，得2.52 g黃色粉末，為靈芝粗多糖CGLP（Crude Ganoderma Lucidum polysaccharides）。將靈芝粗多糖CGLP溶于水，經(jīng)Sephacryl S-300凝膠柱層析，獲得一個主要靈芝多糖純化組分GLP，經(jīng)水透析、凍干后得淺黃色絮狀粉末為GLP。采用蒽酮-硫酸法測定靈芝多糖GLP糖含量。考馬氏亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì)GLP的蛋白質(zhì)含量，

1.3靈芝多糖純化組分的分子量及分布

靈芝多糖的分子量及分布采用高效液相凝膠滲透色譜法 （HPGPC）分析。以Dextran Stan-dard T系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T-10，T-40，T-70，T-500和 T-2000（分子量分別為:10000，40000，70000，500000和2000000）配制成質(zhì)量百分比濃度為0.1%的水溶液。配制相同濃度的靈芝多糖水溶液。

HPGPC分析條件： 色譜柱 TSK-GEL G3000PWXL 7.8 mm×300 mm；流動相：H2O；流速：0.55 mL/min；進(jìn)樣量15 μL；蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），載氣為氮?dú)猓魉?.5 L/min。以標(biāo)準(zhǔn)品重均相對分子質(zhì)量對數(shù)lgMr與保留時間tR線性回歸方程為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算GLP分子量。

1.4單糖組成分析

取純化的靈芝多糖樣品5 mg，加入2 mol/L三氟乙酸3.0 mL，封管。105℃水解9 h，冷卻后減壓抽去TFA。加少量甲醇，減壓抽干，反復(fù)幾次以除去TFA。最后將水解產(chǎn)物溶于蒸餾水。水解產(chǎn)物進(jìn)行糖醇乙酸酯衍生化［5］。水解產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)單糖用硼氫化鈉還原，滴入醋酸分解過量硼氫化鈉，減壓蒸干后加入甲醇反復(fù)處理蒸干。加入醋酐：無水吡啶 （1∶1）于100℃水浴乙酰化20 min，重溶于氯仿進(jìn)行氣相分析。氣相分析條件：HP25 5%苯甲基硅烷毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm ×0.25 μm）。程序升溫110℃至280℃，5℃/min，保留2 min，F(xiàn)ID檢測器，載氣為氮?dú)猓魉?5.0 mL/min，檢測器溫度300℃。

2　結(jié)果與分析

2.1GLP化學(xué)組成

蒽酮硫酸法測得純化制備的GLP總多糖質(zhì)量百分含量為88.65%，蛋白質(zhì)含量為6.23%。靈芝多糖為一種結(jié)合蛋白肽的多糖復(fù)合物。GC分析表明靈芝多糖GLP的多糖部分由6種單糖組成（見表1），分別為葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖，各單糖組成的摩爾比表明GLP以葡萄糖和半乳糖為主，占到總糖組成的近90%。

表1　靈芝多糖GLP的單糖組成及摩爾比

2.2GLP的分子量分析

靈芝多糖GLP的HPGPC-ELSD圖譜見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=-0.38X+9.72 r2=0.9920，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，靈芝多糖GLP主要組分的重均相對分子量為91626。

圖1　靈芝多糖GLP的HPGPC-ELSD圖譜Fiure 1 HPGPC-ELSD Chromatogram of GLP

3　結(jié)論

對單糖及寡糖類的分析，傳統(tǒng)的方法是紙層析和薄層層析法，后來發(fā)展了更為準(zhǔn)確的HPLC法，而糖類在紫外區(qū)無吸收，只能采用衍生化法或示差折光檢測器，這些方法存在靈敏度及基線漂移等諸多因素的影響［6］。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）能夠測定沒有紫外吸收或?yàn)樽贤饽┒巳跷盏臉悠罚烊划a(chǎn)物中的許多成分無疑找到了直接、準(zhǔn)確的測定方法。目前，國內(nèi)外已有應(yīng)用HPLC-ELSD法檢測這類大分子物質(zhì)的報道，如黃芪多糖、云芝糖肽、天花粉蛋白等有少許關(guān)于應(yīng)用HPLC-ELSD的分析研究［7-8］。本研究采用基于蒸發(fā)光散射檢測器的高效液相凝膠滲透色譜（HPGPC-ELSD）測定獲得靈芝多糖的重均相對分子量為91626，并分析其單糖組成以葡萄糖和半乳糖為主。研究成果為進(jìn)一步開發(fā)靈芝多糖并為其進(jìn)行質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持。

［1］劉美琴，李建中，孔繁祚.靈芝多糖的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報，1998，25（3）:173-175.

［2］喬英，董學(xué)暢，邱明華.靈芝多糖的研究概況［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，15（2）:134-137.

［3］戴軍，陳尚衛(wèi)，朱松，等.不同來源靈芝孢子粉的多糖分子量分布分析與比較［J］.食品與機(jī)械，2010，26（1）:12-14.

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［5］王賽貞，林樹錢，林志彬，等.高效凝膠滲透色譜法測定雙靈固本散中多糖肽的分子量及其分布［J］.海峽藥學(xué)，2006，18（5）:57-59.

［6］Wu，Y，Hu N，Pan Y，et al.Isolation and characterization of a mannoglucan from edible Cordyceps sinensis mycelium［J］.Carbohydrate Research，2007，342:870-875.

［7］ Wu M，Wu Y，Zhou J，et al.Structural characterisation of a water-soluble polysaccharide with high branches from the leaves of Taxus chinensis var.mairei［J］.Food Chem istry，2009，113:1020-1024.

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Determination of Molecular Weight of Ganoderma Lucidum Polysaccharides and Its Monosaccharides Components Analysis

YE Su-dan
（Zhejiang Economic and Trade Polytechnic，Hangzhou，Zhejiang 310018，China）

Ganoderma lucidum polysaccharides（GLP）have a variety of pharmacological activities.Due to its wide sources，GLP obtains different physical and chemical properties，molecular weight，and chemical structural.In this paper，HPLC gel permeation chromatography（HPGPC-ELSD）was utilized for analyzing molecular weight and distribution of a purified GLP prepared from conventional techniques.Meanwhile，its monosaccharide components were analyzed by GC.Results suggested that the molecular weight of the purified GLP was 91.6 kD，monosaccharides components included glucose，galactose，xylose，rhamnose，arabinose and mannose.This study established a scientific rational analysis method for GLP’s physical and chemical properties，and would lead great significance for the development of GLP.

Ganoderma lucidum polysaccharides；molecular weight；monosaccharides components；determination

1006-4184（2015）12-0052-03

2015-07-23

浙江省科技廳分析測試科技計劃項(xiàng)目（2013C37087）。

葉素丹（1979-），女，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品（食品）安全檢測。E-mail:suda2008@163.com。