SPE-HPLC法測定水中硝基苯酚類化合物

秦承華，王晶晶，張 軍，彭 華，王玲玲，南淑清，李紅亮，吳立業

1．中國環境監測總站，國家環境保護環境監測質量控制重點實驗室，北京 100012

2．河南省環境監測中心，河南 鄭州 450004

硝基苯酚類化合物多為黃色晶體，常被用作合成染料、醫藥、指示劑、橡膠助劑、感光材料等的中間體，有較強的毒性［1-2］。在國外的環境標準中，前蘇聯將飲用水中的硝基苯酚限值規定為0.06 mg/L(鄰、間硝基苯酚)和0.02 mg/L(對硝基苯酚);美國環保局(USEPA)在 2012年《Drinking Water Standards and Health Advisories》［3］中規定了飲用水中對硝基苯酚的終生安全飲用限值(LHA)0.06 mg/L，并且有動物實驗表明，超過此安全限值，會對健康造成損害;USEPA還在《Ambient Water Quality Criteria for Nitrophenols》［4］中規定，二硝基苯酚類限值為68.6 μg/L，三硝基苯酚類限值為 10 μg/L，二硝基甲酚類的限值為12.8 μg/L。目前，在國內標準(如《生活飲用水衛生標準》、《地下水質量標準》、《地表水環境質量標準》)中，并沒有查到關于硝基苯酚類化合物限值的規定。因此，我國制定硝基苯酚在環境水體中的限值及開發迅速有效的硝基苯酚監測分析方法很有必要。

固相萃取法(SPE)是近年發展起來的一種樣品預處理技術。相比于傳統的液液萃取法，SPE大大減少了有機溶劑的使用量［5］，而且回收率高、處理時間短、重現性高［6］，同時還可以實現水中酚類物質的高倍數富集［7］，是一種較為理想的前處理方式。

在涉及硝基酚類化合物的國內外標準分析方法中，氣相色譜(質譜)法［8-12］是最為常用的分析方法，但氣相色譜法適用于具有較好熱穩定性和較好揮發性的目標化合物。雖然利用衍生化法［13-15］可以降低氣相色譜法測定酚類化合物的檢出限，但衍生化法處理步驟比較繁瑣，還可能會損傷色譜柱。而高效液相色譜法適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差的目標化合物，不需要復雜的前處理步驟即可達到較高的靈敏度，所以高效液相色譜法更適合于硝基苯酚類化合物的檢測。本文以固相萃取為前處理條件，用液相色譜法測定水中10種硝基苯酚類化合物。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A液相色譜儀，帶有二極管陣列檢測器;Waters XbridgeTMPhenyl柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);Supelco固相萃取裝置;氮吹濃縮儀;垂直振蕩器;一般實驗室常用儀器。

Waters HLB(6 mL/150 mg)固相萃取柱;0.45 μm針頭式過濾器;玻璃棉(400℃加熱1 h);氯化鈉(105℃烘干2 h);氫氧化鈉;無水硫酸鈉(400℃烘干2 h);濃鹽酸(1.19 g/mL);甲酸(99.8%)、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈均為色譜純;氮氣(純度≥99.999%);干燥漏斗:內徑為40 mm，在漏斗收口處放入一層薄薄的玻璃棉，并加入適量無水硫酸鈉，用5 mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑沖洗干燥漏斗，備用。

硝基苯酚標準儲備液:質量濃度100 mg/L，含10種硝基苯酚的甲醇溶液，包括4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、2，4-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、2，4，6-三硝基苯酚、2，4，6-三硝基間苯二酚、2-甲基-4，6-二硝基苯酚、2-環己基-4，6-二硝基苯酚、3-甲基-4-硝基苯酚、3-甲基-2-硝基苯酚;質量濃度100 mg/L的甲醇溶液單標。儲備液于4℃以下冷藏。

1.2 標準工作液的配制

取1.0 mL硝基苯酚標準儲備液于10 mL標準容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，得到質量濃度為10 mg/L的標準使用液，并根據需要稀釋至適當質量濃度的標準工作液。于4℃以下冷藏。

1.3 色譜條件

柱溫35℃;流速1.5 mL/min;流動相:溶劑A為乙腈(1%甲酸)，溶劑B為水(1%甲酸);A與B體積比1∶4的流動相經40 min線性變化至體積比1∶1，再經10 min線性變化至A與B體積比4∶1的流動相，最后調至A與B體積比1∶4的流動相8 min平衡;色譜柱為 Waters XBridgeTMPhenyl柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);在進行定量時，取各組分在最大吸收波長(見表1)處譜圖積分。在上述色譜條件下，在316 nm波長下的標樣色譜圖見圖1。

表1 各目標化合物紫外最大吸收波長

1.4 樣品處理

對于含有機雜質較多水樣，取1 000 mL水樣于2 000 mL分液漏斗中，加入60 g氯化鈉及適量氫氧化鈉，振搖溶解，調節水樣至pH＞13。再加入二氯甲烷與正己烷體積比1∶1的混合溶液150 mL，振搖，放氣，置于垂直振蕩器上，以220 r/min振搖15 min，靜止20 min以上至有機相和水相充分分離。棄去有機相，保留水相，水相即為凈化后的水樣。較干凈水樣可省去此凈化步驟。

先用5mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑預洗HLB柱，接著用10 mL甲醇分2次活化HLB柱，最后用10 mL水分2次活化HLB柱。向1 000 mL較干凈水樣或凈化后水樣中加入適量濃鹽酸，調節水樣至pH=2，加入10 g氯化鈉和10 mL甲醇，混勻后以5 mL/min的速度流過已經活化好的HLB柱。用5 mL水沖洗HLB柱后，用高純氮氣吹HLB柱至干燥。柱子干燥后，用5 mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑浸泡HLB柱，浸泡15 min后，收集至收集瓶，再用二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑以1.5 mL/min的速度流過HLB柱，并收集至收集瓶中。洗脫液收集完畢后，用干燥漏斗進行干燥，流出液收集至濃縮瓶中。再用3 mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑沖洗收集瓶，并將沖洗液過干燥漏斗進行干燥，收集至濃縮瓶中，再用2 mL二氯甲烷與乙酸乙酯混合溶劑沖洗干燥漏斗，并收集至濃縮瓶中。用氮吹儀濃縮至0.5 mL，加入10 mL乙腈，再濃縮至1 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣。

圖1 316 nm波長下的標樣色譜圖

2 結果與討論

2.1 凈化

實驗中參考 EPA Method 3650B的方法［16］，利用酸堿分配理論來凈化廢水水樣中含有的可能會產生干擾的芳香族醛醚、多環芳烴等有機物［7］，利用酚類化合物在強堿性條件下以鹽類形式存在、而鹽類物質在水中溶解度較大的原理來凈化水樣。

最初，嘗試使用C18和HLB固相萃取小柱來凈化水樣。將水樣調至pH＞13后，使其流過C18(HLB)固相萃取小柱以去除可能會產生干擾的有機物，收集流出的水樣，再將水樣 pH調至pH=2，再用C18(HLB)固相萃取小柱對目標物質進行富集，然后用溶劑洗脫目標物。但結果發現，萃取效率很差，尤其是相對分子質量比較大的目標化合物，損失率很高。因而考慮使用液液萃取的方式來凈化水樣，實驗中選用二氯甲烷與正己烷體積比1∶1的混合溶劑作萃取劑來凈化水樣，能取得較滿意的效果。

2.2 固相萃取條件的優化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

按照填料種類的不同，固相萃取柱可以分為鍵合硅膠、高分子聚合物、吸附型填料、混合型和專用柱系列等。其中，鍵合硅膠為固相萃取柱最常用的吸附劑，代表產品主要有C18、C8等;高分子聚合物是以極性官能化高分子樹脂為主體的新型反相固相萃取材料，它克服了傳統C18柱存在的缺點，提高了對極性化合物的保留能力以及重現性。實驗用Agilent Bond Elut C18柱(6 mL/500 mg)和 Waters Oasis HLB柱(6 L/150 g)進行了比較實驗，結果見圖2。從圖2可見，在此實驗條件下，HLB柱(6 L/150 g)的萃取效率優于C18柱(6 mL/500 mg)的萃取效率。而且，HLB小柱的pH使用范圍為0～14，具有較強的酸堿耐受性。

圖2 Agilent Bond Elut C18柱和Waters Oasis HLB柱萃取效率對比實驗

2.2.2 水樣pH對萃取效率的影響

硝基苯酚類化合物含有酚羥基，在水中容易電離，以離子狀態存在，會對固相萃取柱的萃取效率產生影響。實驗對不同pH下的HLB小柱的萃取效率進行了比較，結果見圖3。從圖3可見，當pH≤2時，HLB固相萃取柱的萃取效率能達到較滿意效果，所以實驗中將水樣調至pH=2，再進行目標化合物的富集，以提高HLB萃取柱對目標化合物的萃取效率。

2.2.3 洗脫劑的選擇

選定固相萃取柱后，根據固相萃取柱和目標物質的極性，需要選擇與之相配的洗脫劑。實驗對比了甲醇、二氯甲烷、二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑作為洗脫劑的洗脫效率。從圖4可見，用二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑作洗脫劑時的萃取效率明顯優于用甲醇、二氯甲烷做洗脫劑時的萃取效率。因此，實驗最終選擇二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑作為洗脫劑。

圖3 pH吸附效率曲線

圖4 3種洗脫劑萃取效率比較

2.2.4 洗脫劑使用劑量的選擇

考慮到濃縮時間及對環境的影響，在保證回收率的前提下，洗脫劑使用劑量應該盡可能的少。在確定好洗脫劑后，又對二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑的使用劑量進行了實驗，結果見圖5。結果顯示，在使用劑量達到10 mL后，洗脫劑的洗脫效率趨于穩定。最終確定洗脫劑的使用量為10 mL。

圖5 淋洗曲線

2.3 方法性能指標

2.3.1 標準曲線

取一定量硝基苯酚標準使用液于甲醇溶劑中，制備8個濃度點的校準系列，進樣量為10 μL。10種硝基苯酚類目標物的標準曲線及其相關系數見表2。

2.3.2 方法檢出限及測定下限

以實驗室超純水為空白樣品，配制成目標物濃度為預計方法檢出限2～5倍(0.3～0.6 μg/L，1 000 mL水樣)的加標樣品。按照樣品分析的全步驟處理(凈化、富集、濃縮)，進樣量為10 μL。平行測定7個加標樣。按照HJ 168—2010的要求計算方法檢出限和測定下限，結果見表2。

表2 硝基苯酚類物質標準曲線方程及方法檢出限和測定下限

2.3.3 加標回收率及精密度

根據HJ 168—2010的要求，測定了空白水樣加標高質量濃度(4.0～6.0 μg/L)、中質量濃度(2.0～3.0 μg/L)、低質量濃度(0.5～0.8 μg/L)3種情況下的精密度和加標回收率，結果見表3。

表3 空白及實際水樣精密度及準確度測定結果 %

采集了某制藥廠的廢水水樣，按第1.4節的步驟對樣品進行處理，并未檢測出硝基苯酚類化合物。并用該水樣測定了實際水樣加標高質量濃度(4.0 ～7.0 μg/L)、中質量濃度(2.0 ～3.5 μg/L)、低質量濃度(0.5～1.2 μg/L)3種情況的精密度和加標回收率。實際水樣加標后經凈化步驟去除芳香族醛醚、多環芳烴等可能會產生干擾的有機物，再對凈化后的加標水樣進行富集濃縮測定，然后計算得到實際水樣的精密度和加標回收率，結果見表3。

2.4 實際水樣的測定

采集了某石油化工企業的廢水水樣，按照第1.4節的步驟對水樣凈化后進行富集濃縮，測得水樣中含有 0.5 μg/L 的鄰硝基苯酚、0.8 μg/L的 2，4，6-三硝基間苯二酚、1.1 μg/L 的 2，4，6-三硝基苯酚、0.6 μg/L 的 4，6-二硝基鄰甲酚。

3 結論

實驗建立了以固相萃取為前處理條件，液相色譜法測定水中10種硝基苯酚類化合物的分析方法，并對該方法進行了實驗室內驗證。該方法具有較高靈敏度，操作簡便，空白水樣和實際水樣的加標回收率及相對標準偏差結果均在較滿意范圍內。該方法適用于水中硝基苯酚類化合物的測定。

［1］李娟，王薈．水中多種酚類化合物同步提取方法研究［J］．中國環境監測，2013，29(4):85-88．

［2］康春莉，郭平，李軍，等．水體中酚類化合物分光光度分析方法的研究［J］．中國環境監測，2002，18(5):58-63．

［3］EPA 822-S-12-011 2012 Edition of the Drinking Water Standards and Health Advisories［S］．

［4］EPA 440580063 Ambient water quality criteria for nitrophenols［S］．

［5］潘海祥，麥碧嫻，傅家謨，等．環境水質中酚類優先監測物的分析方法［J］．中國環境監測，1999，15(3):53-57．

［6］穆肅．固相萃取-氣相色譜/質譜(GC/MS)法測定水中硝基酚類化合物［J］．科技傳播，2012(21):100-101．

［7］胡秋芬，楊光宇，黃章杰，等．固相萃取-高效液相色譜法測定水中酚類物質［J］．化學分析研究簡報，2002，30(5):560-563．

［8］HJ 676—2013 水質酚類化合物的測定液液萃取/氣相色譜法［S］．

［9］EPA Method 1625 Revision B Semivolatile Organic Compounds by Isotope Dilution GC/MS［S］．

［10］EPA Method 8041A Phenols by Chromatography［S］．

［11］EPA Method 8270D Semivolatile Organic Compounds by Gas Chromatography/Mass Spectrometry(GC-MS)［S］．

［12］ISO 17495:2001 Water quality-Determination of selected nitrophenols-Method by solid phase extraction and gas chromatography with mass spectrometric detection［S］．

［13］EPA Method 8041A Phenols by Chromatography［S］．

［14］ISO 17495:2001 Water quality-Determination of selected nitrophenols-Method by solid phase extraction and gas chromatography with mass spectrometric detection［S］．

［15］EPA Method 604 Phenols［S］．

［16］EPA 3650B Acid-base partition cleanup［S］．