響應面法優化人參花多糖的提取工藝

萬茜淋，焦麗麗，馬林，王明珠，劉淑瑩，2

（1.長春中醫藥大學　吉林省人參科學研究院，長春　130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，長春　130022）

響應面法優化人參花多糖的提取工藝

萬茜淋1，焦麗麗1，馬林1，王明珠1，劉淑瑩1，2

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，長春130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，長春130022）

以人參花為原料，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法，利用中心組合試驗設計原理，對人參花多糖提取工藝中的各影響因素進行優化。以提取時間、液料比、提取次數和提取溫度為試驗因素，人參花多糖提取率為響應值，進行四因素五水平試驗建立模型，獲得多元二次回歸方程。結果表明：提取時間2.495h，液料比38.55∶1（g/g），提取次數5次，提取溫度80℃時，人參花多糖提取率預測值為13.94%。最佳條件下人參花多糖提取率為13.81±0.28%，表明實測值與理論值之間具有良好的擬合度，回歸模型切實可行，優化的工藝條件可用于人參花多糖提取。

人參；多糖；提取；響應面分析法

人參（Panax Ginseng C.A.Meyer），刺五加科植物，在中國、韓國和日本等傳統醫學中廣泛使用，具有補氣生津，鎮靜等功效。人參中富含多種活性成分，包括人參皂苷、人參多肽、人參多糖等。中外學者對人參中上述成分的功能特性和藥用價值已進行廣泛而深入的研究［1，2］。近年來研究發現，人參多糖不僅具有免疫調節作用，同時具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗黏連以及降糖等活性［3-7］。Shin等人研究發現，人參葉和人參果可能具有與人參根相似的藥理活性，從而在臨床上得到應用［8］。然而，目前關于人參花的研究少之甚少，特別是對人參花的多糖研究尚未見報道。

響應面法（Response Surface Methodology，RSM）是一種應用廣泛的試驗優化方法，它能夠有效快速地確定多因子系統的最佳條件，已應用于多種優化試驗中［9，10］。響應面法通過建立回歸分析模型，縮短試驗前期條件摸索的時間。因此，本研究采用響應面法，通過中心組合試驗設計（CentralComposite Design，CCD）原理，優化人參花多糖（Ginseng Flower Polysaccharides，GFP）的提取條件，提高GFP的提取率，為人參花多糖的深入研究和開發利用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

人參花采集于中國吉林省撫松縣人參種植基地，經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定為為五加科植物人參Panax ginseng的干燥花蕾。單糖標準試劑購于Sigma化工有限公司（St.Louis，MO，USA）。

試驗中所有化學試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

臺式高速離心機（Eppendorf公司）；恒溫水浴鍋（北京醫療設備廠）；AB 135-S電子分析天平（METTLER TOLEDD公司）；粉碎機（歐凱萊芙寶業公司）；KQ-500DA型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1多糖提取工藝流程

人參花粉碎→95%乙醇回流→離心→沉淀干燥→水提→醇沉→沉淀復溶→凍干→計算多糖提取率。

1.3.2多糖提取率計算

GFP提取率計算公式如下：

其中，m0（g）表示干燥GFP重量，m（g）表示干燥原料重量。

1.3.3單因素試驗設計

分別對不同的提取溫度（40、50、60、70、80、90、100℃）、液料比（10、15、20、25、30、35、40、45，g/g）、提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h）和提取次數（1、2、3、4、5、6、7次）進行單因素試驗，考察各單因素對GFP提取率的影響。

1.3.4響應面法試驗設計

通過單因素試驗確定的四個獨立變量范圍后，采用CCD設計法提供的方案進行試驗（分別標記為：X1，提取時間；X2，液料比；X3，提取次數；X4，提取溫度）［11］。根據CCD設計原理，選取對試驗結果有顯著影響的因素及其范圍，設計四因素五水平的響應面試驗方案，如表1所示，從而獲得最佳條件組合。

表1　Central composite試驗設計因素水平

CCD試驗按照以下方程設計：

其中，Xi表示獨立變量的編碼值，也是實際變量的值。X0表示獨立變量中心點的值。ΔXi是獨立變量的差值。

設計的31組試驗方案以隨機次序進行，如表2所示，每組試驗進行3次平行操作，計算得到平均響應值，通過程序分析，得出響應面分析圖、擬合方程以及方差分析表，通過Design-Expert 8.0.5b軟件中的程序對試驗結果進行響應面分析，經二次回歸擬合后，求得響應函數如公式（3）得出回歸方程：

其中，Yk代表響應函數（GFP提取率），βk0表示截距，βki，βkii和βkij分別代表線性系數，二次系數，交叉系數。xi和xj代表獨立變量。

2　結果與討論

2.1單因素試驗結果

2.1.1提取溫度對GFP提取率的影響

在提取時間2h，液料比35（g/g），提取次數4次的條件考察不同提取溫度對GFP提取率的影響。結果如圖1（a）所示：提取溫度從40℃升高到80℃時，GFP提取率從8.1%增加到9.2%。提取溫度持續升高到100℃時，GFP提取率依然增加，但是隨著提取溫度的升高，會對GFP化學結構產生影響，工業化生產過程中也會增加成本。因此，最佳提取溫度范圍確定為50～90℃。

2.1.2提取時間對GFP提取率的影響

在提取溫度70℃，液料比35（g/g），提取次數4次的條件考察不同提取時間對GFP提取率的影響。結果如圖1（b）所示：隨著提取時間從0.5h增加到2h，GFP提取率明顯增加，提取時間2h時，提取率最大，為9.2%，但是超過2h后，GFP提取率下降。因此，最適宜的提取時間范圍確定為1～3h之間。

2.1.3液料比對GFP提取率的影響

在提取溫度70℃，提取時間2h，提取次數4次條件下考察不同液料比，對GFP提取率的影響。結果如圖1（c）所示：液料比從10到45（g/g），GFP提取率從6.98%增加到14.68%。因此，最佳液料比范圍確定在25～45（g/g）。

2.1.4提取次數對GFP提取率的影響

在提取溫度70℃，提取時間2h，液料比35（g/g）條件下考察提取次數對GFP提取率的影響。結果如圖1（d）所示：GFP提取率隨著提取次數的增加持續升高，從5.89%升高到13.29%。為節約成本，最佳提取次數范圍選定在2～6次。

根據上述單因素試驗研究結果，響應面法優化試驗提取參數范圍如下：提取溫度50～90℃；提取時間1～3h；液料比25～45（g/g）；提取次數2～6次（見表1）。

圖1　提取溫度

2.2響應面法優化GFP提取工藝

2.2.1Central composite試驗設計及結果

與傳統的單因素優化方法相比，RSM法具有節省時間、空間和原材料的優勢［12］。根據單因素試驗結果，利用CCD法，為GFP提取設計31組優化方案。各組試驗響應值（GFP提取率，Y，%）如表2所示，GFP提取率在9.48%～14.78%之間。

2.2.2模型建立及擬合模型

CCD設計方案與響應值結果如表2所示。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對表2中數據進行多項式回歸分析、F檢驗和方差分析，結果如表3所示。

同時，對試驗參數及結果進行回歸擬合，得到GFP提取率與各因素變量間的多項式方程如下（R2=0.93）：

表2　中心組合試驗設計方案與GFP響應值

模型擬合方面，方程F值為14.91，P＜0.0001，說明使用上述回歸方程描述提取參數與響應值之間的關系時，能夠正確反映因變量與自變量之間的關系，模型高度顯著，證實該試驗方法的可靠性和準確性；此模型決定系數R2=0.9288，表明回歸方程擬合較好；失擬項P＜0.0001，說明由噪音引起模型偏差的概率小于0.01%；模型校正決定系數Radj2=0.8665，表明本實驗86.65%的數據變異可以用此回歸方程解釋，能夠較好地確定關鍵影響因素；離散系數（C. V.%=3.44%）表示試驗的精確度，離散系數越低，說明試驗數值有較高的精度和可靠性［13］。綜上所述，該模型能夠用于表示提取參數和GFP提取率的關系，具有較高應用價值。

表3　中心組合試驗設計試驗結果方差分析及顯著性檢驗

P值用于衡量回歸方程中每個系數的準確性，進而了解獨立變量之間的交互作用影響。P＜0.05表明該系數是非常有意義的［14］。由回歸方程系數顯著性檢驗可知，表3的線性系數（X1，X2，X3，X4）中，X2、X3、X4影響極顯著（P＜0.01），X1影響顯著（P＜0.05）；二次項系數（X12，X22，X32，X42）中，X12，X32影響極顯著（P＜0.01），X42影響顯著（P＜0.05）；交叉乘積系數（X1X2，X1X3，X1X4，X2X3，X2X4，X3X4）中，僅有X1X2影響顯著（P＜0.05）。綜上所述，各試驗因素對響應值并不是簡單的線性關系，二次項對響應值的影響也有很大的關系，交互作用的影響相對較小。此外，其他的顯著性差異都大于0.05，說明影響不是很明顯。因此，X1、X2、X3、X4、X12、X32、X42和X1X2表示的參數都是GFP提取過程中重要的因素。針對4個提取參數的研究中，各因素對響應值的影響排序為：提取溫度＞提取次數＞液料比＞提取時間。

2.2.3響應面圖及等值線圖分析

RSM方法的數據圖形是根據特定的響應值Y與各因素X1，X2，X3，X4之間構成的二維和三維圖像，響應圖中曲線越陡峭，則表明相對應因素對響應值的影響越大，響應值變化越大。三維響應面圖能夠直觀反映出各因素對GFP提取率的影響以及各因素之間的相互作用。響應圖中等高線形狀也能夠直觀反映出兩因素之間交互作用大小，等高線呈現橢圓形體現兩因素交互效應顯著，而圓形則說明因素間交互作用較弱。回歸方程的2D等值線圖和3D響應面圖見圖2和圖3。2D等高線圖和3D響應面圖整體趨勢一致。

圖2　提取時間（X1），液料比（X2），提取次數（X3）及提取溫度（X4）對GFP提取率的3D響應面圖

為了研究可變參數之間的關系，每圖表示兩個變量，其他兩個參數保持在一定水平（0水平，參見表1）。液料比和提取時間不同的情況下，3D響應面圖和2D等值線圖如圖2（a）和3（a）所示，結果表明：提取時間對GFP提取率影響較小，當提取時間較短時，液料比和提取時間出現了交互作用，對提取率的影響較明顯；圖2（b）和3（b）表示提取時間和提取次數交互作用，當提取次數固定在某一水平時，隨著時間的延長GFP提取率增加，隨后呈下降趨勢；由圖2 （c）和3（c）可以看出，當提取時間從1h增加到2.5h時，提取溫度對GFP提取率有非常積極的影響，超過2.5h以后，多糖的提取率逐漸下降；如圖2（d）和3 （d）所示，當提取次數為5時，液料比的積極作用十分明顯，即GFP提取率隨著液料比的增加而增加，但超過5次后GFP提取率呈下降趨勢；根據圖2（e）和3（e）得知，GFP提取率隨著液料比和提取溫度的增加而升高，結果與前期單因素試驗的結果相一致；圖2f與3f體現了提取溫度和提取次數對GFP提取率的交互影響，提取次數小于5時，隨著提取溫度的增加，多糖提取率明顯增加，但是超過5次時，GFP提取率開始下降。因此，GFP最高提取率是當提取溫度和提取次數分別為80℃和5次的條件下出現的。

根據分析結果，回歸模型預測的GFP提取最佳工藝條件為：提取時間2.495h，液料比38.55（g/g），提取次數5次，提取溫度80℃。在此條件下，GFP提取率理論值可達13.94%。

圖3　提取時間（X1），液料比（X2），提取次數（X3）及提取溫度（X4）對GFP提取率的2D等值線圖

2.2.4提取工藝優化及預測模型驗證

為了驗證模型預測理論值的準確性和真實性，我們根據模型預測的優化條件進行3次平行試驗，結果GFP提取率平均值為13.81±0.28%，與模型預測理論值13.94%相近，說明響應面優化的條件是合理有效的，具有極強的應用價值和指導意義。

3　結論

本研究以單因素試驗方法作為基礎，確定主要影響人參花多糖提取產量的因素及范圍，結合CCD設計，確定最佳響應面區域，優化人參花中多糖提取的工藝條件，優化參數為：提取時間2.495h，液料比38.55（g/g），提取次數5次，提取溫度80℃。上述條件下，GFP提取率為13.81±0.28%，與理論值13.94%相近，說明該模型比較可靠。

熱水浸提法是一種從植物中提取多糖的傳統方法。將RSM應用于人參花多糖的提取過程中，通過建立數據模型的方法，解決受多因素的影響的最優組合問題，提高人參花多糖的提取率。與傳統的單因素試驗相比，該方法不僅能夠節約條件摸索的時間，降低提取成本，同時能夠達到最高的提取率，是研究多因素試驗有力的工具，該方法在人參花多糖提取中的應用，不僅為人參花多糖的提取奠定了理論基礎，并為人參花多糖的實際工業提取提供理論依據。

［1］Liu Changxiao，Xiao Peigen.Recent advances on ginseng research in China［J］.Journal of Ethnopharmacology，1992（36）：27-38.

［2］Gillis C N.Panax ginseng pharmacology：a nitric oxide link［J］.Biochemical Pharmacology，1997，54 （1）：1-8.

［3］Ni Weihua，Zhang Xu，Wang Bo，et al.Antitumor activities and immunomodulatory effects of ginseng neutral polysaccharides in combination with 5-Fluorouracil［J］.Journal of Medicinal Food，2010，13（2）：270-277.

［4］Luo Dianhui，Fang Baishan.Structural identification of ginseng polysaccharides and testing of their antioxidant activities［J］.Carbohydrate Polymers，2008，72 （3）：376-381.

［5］ Song J Y，Han S Y，Bae K G，et al.Radioprotective effects of ginsan，an immunomodulator［J］.Radiation Research，2003，159（6）：768-774.

［6］Lee Jihye，Shim Jinsun，Lee Jungsun，et al.Pectin-likeacidicpolysaccharidefromPanaxginseng with selective antiadhesive activity against pathogenic bacteria［J］.Carbohydrate Research，2006，341（9）：1154-1163.

［7］Suzuki Y，Hikino H.Mechanisms of hypoglycemic activityofPanaxansAandB，glycansofPanax ginseng roots：effects on the key enzymes of glucose metabolism in the liver of mice［J］.Phytotheraphy Research，1989，3（1）：15-19.

［8］ Shin Kwangsoon，Kiyohara Hiroaki，Matsumoto T，et al.RhamnogalacturonanIIfromtheleavesof Panax ginseng C.A.Meyer as a macrophage Fc receptor expression-enhancing polysaccharide［J］.Carbohydrate Research，1997，300（3）：239-249.

［9］Patil Prafulla D，Gude Veera Gnaneswar，Mannerswamy Aravind，et al.Optimization of microwave—assisted transesterification of dry algal biomass usingresponsesurfacemethodology［J］.Bioresource Technology，2011，102（2）：1399-1405.

［10］ Yang Wenjian，Fang Yong，Liang Jin，et al.Optimization of ultrasonic extraction of Flammulina velutipes polysaccharides and evaluation of its acetylcholinesterase inhibitory activity［J］.Food Research International，2011，44（5）：1269-1275.

［11］ Box G E P，Behnken D W.Some new three level designs for the study of quantitative variables［J］. Technometrics，1960，2（4）：455-475.

［12］Sun Yongxu，Liu Jicheng，Kennedy J F.Application of response surface methodology for optimization of polysaccharides production parameters from the roots of codonopsispilosula by a central composite design［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80 （3）：949-953.

［13］ Kuo Wanyuan，Lai Hsimei.Effects of reaction conditions on the physicochemical properties of cationic starch studied by RSM［J］.Carbohydrate Polymers，2009，75（4）：627-635.

［14］ Wang Zhanyong，Wang Chenyu，Quan Yue.Extraction of polysaccharides from Phellinusnigricans myceliaandtheirantioxidantactivities［J］.Carbohydrate Polymers，2014，99（2）：110-115.

Optimization of Polysaccharides from Flowers of Panax Ginseng C.A.Meyer Using Response Surface Methodology

WAN Xilin1，JIAO Lili1，MA Lin1，WANG Mingzhu1，LIU Shuying1，2
（1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117；2.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022）

In this study，response surface methodology based on central composite design（CCD）was adopted to optimize the extraction conditions of polysaccharides from the flower of Panax ginseng C.A.Meyer（GFP）.The effects of four parameters，including extraction time（h），ratio of water to raw material，number of extraction and extraction temperature（°C）were investigated by single factor experiments，yield of the polysaccharides as the response values，the experimental data were fitted to a second-order polynomial equation.The optimum extraction conditions were determined as follow：extraction time 2.495 h，ratio of water to raw material 38.55∶1（g/g），and number of extraction 5，extraction temperature 80°C.Under these conditions，the experimental yield was 13.81±0.28%，which was well matched with the predictive yield of 13.94%.The model was significant that can be used for the extraction of GFP.

panax ginseng C.A.meyer；polysaccharides；extraction；response surface methodology（RSM）

Q539

A

1672-9870（2015）06-0154-05

2015-10-21

國家自然科學基金面上項目（02090106）；吉林省科技發展計劃項目（20130206059YY）

萬茜淋（1987-），女，碩士，助理實驗師，E-mail：wanxilin1987@163.com

劉淑瑩（1943-），博士，研究員，E-mail：syliu@ciac.ac.cn