豌豆根瘤菌透性酶基因突變體的構建及其功能研究

周艷琳等

摘要：為研究豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）3841透性酶基因rl1568的作用，通過同源重組構建了豌豆根瘤菌透性酶基因rl1568突變體。結果表明，rl1568基因突變不影響菌株在自生培養條件下生長，但該基因突變株對低濃度的氧化物十分敏感且生長較差。熒光定量RT-PCR結果表明，H2O2不能誘導rl1568基因表達。植物盆栽試驗發現rl1568基因突變對根瘤菌共生固氮能力無影響。

關鍵詞：豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）；透性酶；rl1568基因； 抗氧化；共生固氮

中圖分類號：Q936 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4613-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.057

細胞膜作為細胞與細胞外環境之間的一種選擇性通透屏障，一方面能保障細胞對基本營養物質的攝取、代謝廢物的排除和細胞內離子濃度的調節；另一方面使細胞維持相對穩定的內環境，因此物質的跨膜運輸對細胞的生存和生長極為重要?？缒まD運過程大部分情況是由膜蛋白介導的，在功能上有時與細胞外受體和細胞質內的調控蛋白相聯系[1-3]，這種蛋白復合體可稱為轉運體，或者透性酶。

根瘤菌是一類能夠以類菌體的形式存在于豆科植物中的革蘭氏陰性菌，一方面將氮氣固定成植物所需氮源；另一方面利用植物所提供的氮源生存。為建立這種共生系統，土壤中的根瘤菌必須在根系環境中大量繁殖，并與其他有機體爭奪養分，而根瘤菌中被發現越來越多的轉運體為根瘤菌在根系定殖時獲得重要的養分如氨基酸[4]。在豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）中，編碼氨基酸透性酶Aap和Bra基因雙突變后，由于不能利用谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸以及天冬氨酸等氨基酸，根瘤菌生長受到明顯影響[5]。另外在肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）中發現作為ABC轉運體的psa透性酶不僅參與Mn2+轉運，同時在系統毒性和抵御超氧化物以及過氧化物中起重要作用[6]。

在豌豆根瘤菌中發現了一種透性酶基因rl1568（NC_008380.1），編碼一個362氨基酸的蛋白質（YP_767172.1），含有6個跨膜區域，屬于YjgP/YjgQ超家族。YjgP/YjgQ超家族存在范圍廣泛，如單獨以膜結構[7]存在，或者與其他結構域構成各種酶如組氨酸激酶[8]以及脂肪酶[9]，其功能推測為透性酶[10]，但具體功能機制尚不清楚。在大腸桿菌中發現屬于YjgP/YjgQ超家族的兩種內膜蛋白YjgP和YjgQ在脂多糖LPS轉運的過程中起重要作用，推測可能為ABC型轉運系統的一部分[11]，而在Rhodopirellula baltica SH 1中則推測為信號肽[12]。因此本研究在構建豌豆根瘤菌3841 rl1568基因突變株的基礎上，通過自生和共生試驗，研究了rl1568基因是否對菌株生長和共生固氮能力有影響，并通過RT-PCR分析相關基因的表達情況，為闡明rl1568基因的調控機制提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種質粒和培養基 豌豆根瘤菌3841和克隆載體pK19mob由英國牛津大學Philip S Poole教授提供。LB培養基[13]用于大腸桿菌培養，豌豆根瘤菌培養所用培養基TY[13]和AMS培養基[14]。培養根瘤菌所用抗生素：鏈霉素（Str）、新霉素（Neo）、卡那霉素（Km）和四環素（Tc），購于Sigma公司，使用濃度為：Str，500 μg/mL；Neo，80 μg/mL；Tc，2 μg/mL；培養大腸桿菌所用抗生素濃度：Km，20 μg/mL； Tc，5 μg/mL。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內切酶Hind Ⅲ 及XbaⅠ，T4 DNA連接酶，RNAiso Plus等（TAKARA公司）；phusion 高保真酶、Taq DNA 聚合酶（Thermo scientific），DNA凝膠回收試劑盒（博大泰克生物技術有限公司），PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），FastStart Universal SYBR Green Master （Roche），752型紫外可見光光度計（上海光譜儀器有限公司），PCR儀（Biometra），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

1.2 rl1568基因插入突變株的構建

rl1568基因突變按照Luo等[15]方法進行，以豌豆根瘤菌3841總DNA為模板，以Pr1568-1F/Pr1568-1R為引物擴增得到目的片段，引物見表1。將擴增得到的產物與空載體pK19mob分別經XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，利用T4 DNA連接酶連接過夜，然后導入DH5α中，經PCR和測序驗證后，獲得陽性克隆質粒pK1568。以含pK1568質粒的大腸桿菌為供體菌，3841為受體菌，含質粒pRK2013的大腸桿菌為輔助菌進行三親本雜交，通過抗性篩選及用引物Pr1568-map/M13F PCR驗證缺失突變株。

1.3 菌株生長情況

1.3.1 無H2O2脅迫條件下菌株的生長情況 將已活化的RL1568和3841經AMS洗脫后，接種于50 mL的AMS培養基中，使初始OD600 nm為0.01，每個菌3個重復，28 ℃下200 r/min于搖床中振蕩培養，每隔一段時間取樣，測定OD600 nm。

1.3.2 抑菌圈試驗 將培養至對數期的待測菌株經生理鹽水清洗并重新溶解后，涂布于AMS瓊脂平板，待平板晾干后將浸有不同濃度氧化物的圓濾紙片放置在平板中央，每個平板一個圓濾紙片，每種濃度3個重復，測定抑菌圈的直徑。氧化物為過氧化氫（H2O2）和過氧化氫異丙苯（CuOOH），其中CuOOH用無水乙醇稀釋成不同濃度。endprint

1.4 qRT-PCR分析相關抗氧化基因的表達量

進行細菌RNA提取[16]時，將3841接種于AMS液體培養基中，使初始OD600 nm為0.01，28 ℃下200 r/min于搖床中振蕩培養至OD600 nm在0.3至0.6之間，菌體離心收集后分別用生理鹽水和0.5 mmol/L H2O2處理1 h，采用Trizol法提取總RNA，然后利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將其反轉錄成cDNA，用相關抗氧化基因的PCR引物和gyrB1內參基因的引物（表1），對cDNA模板進行熒光定量PCR。

1.5 植物盆栽試驗

參照Poole等[17]的方法，采用無菌蛭石盆栽。豌豆種子經表面滅菌催芽處理后，播入已滅菌的蛭石塑料燒杯。栽培大豆用無氮營養液，播種時每顆豌豆上加1 mL相應菌液，一缽2豌豆，3缽重復。蓋好保鮮膜后放入光照培養箱中培養，3周后利用乙炔還原法測量根瘤固氮酶活。

2 結果與分析

2.1 豌豆根瘤菌3841 rl1568基因突變體的構建

參照Karunakaran等[18]突變體構建的方法，利用Pr1568-map/pk19A對重組子進行PCR驗證，成功擴增出1 kb左右的目標片段（圖1），獲得rl1568基因突變株RL1568。

2.2 rl1568基因突變后豌豆根瘤菌對H2O2敏感

2.2.1 rl1568基因突變不影響菌株正常生長 將RL1568和3841分別接種于AMS培養基上，使初始OD600 nm為0.1，每隔一段時間測定其OD600 nm。結果（圖2）表明，突變株RL1568的生長情況與野生型3841無明顯區別，表明rl1568基因對豌豆根瘤菌3841生長無明顯影響。

2.2.2 rl1568基因突變影響豌豆根瘤菌抗氧化能力 選取H2O2和CuOOH作為過氧化物，研究了不同濃度下野生型3841和突變株RL1568的抑菌圈直徑（表2）。當H2O2以及CuOOH濃度在100 mmol/L和50 mmol/L時，培養24 h后，突變株抑菌圈直徑相對于野生型3841很大，有顯著性差異；而在高濃度情況下兩者相差不大。表明rl1568基因對低濃度的H2O2和CuOOH更為敏感。

2.3 抗氧化相關基因的表達分析

進行RT-PCR后，并用2-ΔΔCt進行處理，以生理鹽水處理的3841為對照，0.5 mmol/L H2O2處理的3841中rl1568基因的表達量為0.98±0.5，表明rl1568基因表達不受H2O2的影響。

2.4 植物盆栽試驗

將突變株RL1568和野生型3841接種于豌豆中4周后，突變株RL1568接種的植株能形成粉紅色有效根瘤，用乙炔還原法測定豌豆植株的固氮酶活。結果表明，野生型3841的固氮酶活為3.58±0.44 μmol/（g·h），RL1568為3.39±1.19 μmol/（g·h），兩者固氮酶活無明顯差異，表明rl1568基因突變對根瘤固氮無明顯影響（圖3）。

3 小結與討論

細胞膜的外膜結構OM作為一種選擇性透性屏障阻擋有毒物質比如去污劑和抗生素[19]。根瘤菌與豆科植物共生固氮中，根瘤菌分泌的外膜蛋白對根毛的吸附、根瘤及侵染結構的形成、保護細胞免受植物防衛反應的作用等方面都有重要作用[20]。

在本試驗中，發現透性酶rl1568基因突變雖然對豌豆根瘤菌3841正常生長并無明顯影響，但對低濃度的氧化物如H2O2和CuOOH敏感。在低濃度的氧化物濃度下，突變株RL1568的抑菌圈直徑比野生型3841明顯大很多，但當氧化物濃度提高時，兩者并無明顯差別。經H2O2處理后，野生型菌株中rl1568基因表達量為0.98±0.5，說明rl1568基因表達并不受外界H2O2影響。此外通過盆栽試驗發現，rl1568基因突變并不影響豌豆根瘤菌的固氮能力。rl1568基因編碼產物屬于YjgP/YjgQ透性酶，目前還沒有關于YjgP/YjgQ透性酶抗氧化相關的報道，對rl1568基因及YjgP/YjgQ透性酶在抗氧化中的機制還有待深入研究。

參考文獻：

[1] HIGGINS C F.The ABC of channel regulation[J].Cell，1995， 82（5）：693-696.

[2] REIZER J， SAIER J M H. Modular multidomain phosphoryl transfer proteins of bacteria[J]. Current Opinion in Structural Biology，1997，7（3）：407-415.

[3] SAURIN W， HOFNUNG M， DASSA E. Getting in or out： Early segregation between importers and exporters in the evolution of ATP-binding cassette （ABC） transporters[J]. Journal of Molecular Evolution， 1999， 48（1）： 22-41.

[4] HOSIE A H F， ALLAWAY D， POOLE P S. A monocarboxylate permease of Rhizobium leguminosarum is the first member of a new subfamily of transporters[J]. Journal of Bacteriology， 2002， 184（19）： 5436-5448.endprint

[5] MCALLISTER L J，TSENG H J，OGUNNIYI A D，et al. Molecular analysis of the psa permease complex of Streptococcus pneumoniae[J]. Molecular Microbiology，2004，53（3）：889-901.

[6] HOSIE A H F，ALLAWAY D，GALLOWAY C S，et al. Rhizobium leguminosarum has a second general amino acid permease with unusually broad substrate specificity and high similarity to branched-chain amino acid transporters （Bra/LIV） of the ABC family[J]. Journal of Bacteriology，2002，184（15）：4071-4080.

[7] KANEKO T，SATO S，KOTANI H，et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803.Ⅱ. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions[J]. DNA Research，1996，3（3）：109-136.

[8] THOMSON N R， HOWARD S， WREN B W， et al. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081[J]. PLoS Genetics，2006，2（12）：e206.

[9] WANG Y， LI X， MAO Y， et al. Genome-wide dynamic transcriptional profiling in Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 using single-nucleotide resolution RNA-Seq[J]. BMC Genomics， 2012， 13（1）： 102-117.

[10] FINN R D， MISTRY J， SCHUSTER-B？魻CKLER B， et al. Pfam： Clans， web tools and services[J]. Nucleic Acids Research， 2006， 34（s1）： 247-251.

[11] RUIZ N， GRONENBERG L S， KAHNE D， et al. Identification of two inner-membrane proteins required for the transport of lipopolysaccharide to the outer membrane of Escherichia coli[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2008， 105（14）： 5537-5542.

[12] GL？魻CKNER F O，KUBE M，BAUER M，et al.Complete genome sequence of the marine planctomycete Pirellula sp. strain 1[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2003， 100（14）： 8298-8303.

[13] JOSEPH S， DAVID W R，HUANG P. Molecular Cloning-A Laboratory Manual[M].Beijing： Science Press，2002.

[14] WHITTENBURY R， PHILLIPS K C，WILKINSON J F. Enrichment， isolation and some properties of methane-utilizing bacteria[J]. Journal of General Microbiology， 1970， 61（2）： 205-218.

[15] LUO L，YAO S，BECKER A，et al.Two new Sinorhizobium meliloti LysR-type transcriptional regulators required for nodulation[J].Journal of Bacteriology，2005，187（13）： 4562-4572.

[16] 彭杰麗.基于全局轉錄組分析研究華癸中慢生根瘤菌7653R 類菌體分化和固氮機理[D].武漢：華中農業大學，2014.

[17] POOLE P S，BLYTH A，REID C J，et al. Myo-Inositol catabolism and catabolite regulation in Rhizobium leguminosarum bv. Viciae[J]. Microbiology， 1994， 140（10）： 2787-2795.

[18] KARUNAKARAN R， HAAG A F， EAST A K， et al. BacA is essential for bacteroid development in nodules of galegoid， but not phaseoloid， legumes[J]. Journal of Bacteriology， 2010， 192（11）： 2920-2928.

[19] NIKAIDO H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2003， 67（4）： 593-656.

[20] 程國軍，周俊初，李友國.華癸中生根瘤菌脂多糖突變株的共生能力[J].中南民族大學學報，2008，27（2）：11-13.endprint