固定化HPR催化降解染料廢水中的剛果紅

王亞麗等

摘要：研究了以固定化的辣根過氧化酶為催化劑，催化H2O2氧化降解剛果紅染料，考察了影響剛果紅染料降解率的幾個重要因素，包括pH、溫度、反應時間、H2O2濃度、染料初始濃度等，確定其最佳條件為pH 3.5，固定化酶用量0.5 g，H2O2濃度1.0 mmol/L，底物濃度0.1 mmol/L，反應溫度40 ℃，反應時間30 min，降解率達到91.6%。催化劑重復使用4次后降解產率仍可達到22.0%，同時采用質譜對降解后的產物進行了分析。

關鍵詞：剛果紅染料；辣根過氧化物酶；固定化；降解

中圖分類號：O643.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4441-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.014

染料廢水中含有多種具有生物毒性或導致人體病變的有機物，癌癥與環境因子有關，致癌物是有毒的有機物，其中包含部分有機染料，如偶氮類染料，它占全球所用染料的80%，因其結構中的偶氮基常與一個或多個芳香環系統相連構成一個共軛體系作為染料的發色體，對人體有極不利的影響。據2004年統計我國每年大約有2×103～3×103 t的染料會直接隨著廢水排入環境中，而目前我國工業廢水的治理率約為87.4%，治理合格率僅為處理總量的63%[1]。含有偶氮類染料的工業廢水的特點是色度大，組成復雜，難降解，對環境的污染很大，同時因其化學性質較穩定，生物可降解性低，因此偶氮染料廢水是公認的難治理的高濃度有機廢水[2-5]。剛果紅染料是典型的雙偶氮染料，分子式為C32H22N6Na2O6S2，結構式如圖1所示，它可以作為一種酸堿指示劑來使用，當pH小于3.5時為藍紫色，當pH大于5.3時為紅色。它也被廣泛應用于紡織、造紙和印染等行業[2，3]。

目前，國內外常用的處理染料廢水的方法有3大類：物理法、化學法和生物法。其中生物法因其處理方法簡單易行，二次污染較少而備受關注[6，7]。生物法主要以酶作催化劑，辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是血紅素類過氧化物酶的一種，因其高效的催化性能已成為重要的生物催化劑。它可以處理一些難生物降解的人工合成染料，如含偶氮基團、多環類有機物、高聚物有機物，也被廣泛用于有機合成、生物轉化、發光檢測、免疫檢測、相關酶檢測、臨床化學、電化學、環境化學等領域。

本實驗以海藻酸鈉為載體，戊二醛作為交聯劑，進行辣根過氧化物酶的固定化，并用固定化后的辣根過氧化物酶催化H2O2對雙偶氮染料剛果紅進行降解處理，通過紫外分光光度計的檢測對降解條件進行優化，通過質譜對降解過程進行分析。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

辣根過氧化物酶（阿拉丁化學試劑有限公司）；海藻酸鈉（AR，阿拉丁試劑有限公司）；無水氯化鈣（AR，汕頭市西隴化工廠）；剛果紅（指示劑，AR，阿拉丁試劑有限公司）；30%的H2O2（國藥集團化學試劑有限公司）。

紫外可見分光光度計（UV-1700型，島津國際貿易上海有限公司）；微量連續可調移液器（10-1 000 μL，上海艾本徳有限公司）；液相色譜儀（LC-20AT，日本島津制作所）；電噴霧質譜儀（MS5973，德國布魯克公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣根過氧化物酶的固定化 將1.25 g海藻酸鈉加熱溶解于25.0 mL水中，緩慢加入2.5 mL 濃度為0.097 0 g/mL的辣根過氧化物酶溶液，置于恒溫振蕩器中振蕩10 min，使酶與海藻酸鈉溶液混勻，再分別加入10.0 mL濃度為1.0 mol/L的氯化鈣溶液，繼續在恒溫振蕩器中振蕩20 min，然后取出靜置6 h 后，用蒸餾水充分洗滌5次，然后將固定化辣根過氧化物酶轉移至5%的戊二醛溶液中，于30 ℃下交聯1 h。再用生理鹽水洗滌8次，盡可能去除殘余的戊二醛[8-11]。將制備好的固定化酶置于4 ℃冰箱中備用[12]。

1.2.2 磷酸鹽緩沖溶液的配制 配置0.1 mol/L的pH為1～8的磷酸緩沖溶液備用，因為酶催化降解一般都在某一穩定的pH下進行。

1.2.3 剛果紅染料溶液的配制 準確稱取0.174 2 g剛果紅于50 mL容量瓶中定容，用超純水配制成濃度為5 mmol/L的染料儲備液，以備稀釋成所需不同濃度的剛果紅染料溶液。溶液均置于陰暗干燥處保存。

1.2.4 剛果紅染料特征吸收波長的確定及標準曲線的繪制 在紫外-可見分光光度計上，用1 cm的石英比色皿，以超純水為參比，在400～540 nm的波長范圍內對剛果紅染料溶液掃譜，每隔10 nm記錄不同波長下的吸光度，繪制吸收曲線，如圖2所示，確定其特征吸收波長為488 nm。

在5.0 mL的離心管中，加入1 800 μL pH為2的磷酸緩沖溶液、200 μL 不同濃度的剛果紅染料溶液，30 ℃恒溫10 min，取出溶液加入到1.0 cm的石英比色皿中測定不同濃度的剛果紅染料溶液在其特征吸收波長488 nm處的吸光度，以吸光度-濃度作圖得出剛果紅染料的標準曲線，如圖3所示，剛果紅的初始濃度在0.2～1.6 mmol/L間呈線性關系。因此，把該濃度范圍應用于剛果紅降解的整個實驗中。

1.2.5 脫色率的計算 用紫外可見分光光度計測定剛果紅在其特征吸收波長488 nm處的吸光度值，按下面公式計算染料脫色率：

η=（A0-At）/A0×100%

式中，η為剛果紅的脫色率，A0為剛果紅的初始吸光度，At為t時刻剛果紅的吸光度。

2 結果與分析

2.1 固定化HPR用量對染料剛果紅降解的影響

將固定好成凝膠狀的HPR分別稱取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g加入到200 μL 底物濃度為0.1 mmol/L的剛果紅染料溶液中，使反應體系的pH為4，在40 ℃的恒溫槽中進行試驗，加入1.0 mmol/L H2O2溶液反應。該染料較易被固定化的辣根過氧化物酶降解，反應25 min后不同用量的固定化HPR對染料剛果紅的脫色率分別為54.3%、71.2%、82.9%、82.2%、81.8%。當酶用量在0.5 g以上時，隨著酶用量的增加，剛果紅染料的脫色率基本不變。因此，選擇固定化HPR的用量為0.5 g。

2.2 緩沖溶液pH對固定化HPR降解染料剛果紅的影響

將不同pH的緩沖溶液加入5 mL離心管中，各加入200 μL 1.0 mmol/L的剛果紅溶液，然后分別加入1.0 mmol/L的H2O2溶液，最后加入固定化酶，恒溫40 ℃，反應時間為25 min，考察不同pH的磷酸緩沖溶液對染料脫色降解率的影響，結果如圖4所示。在pH為3.5時降解率最大，為83.2%，而當pH在2～3時對降解率影響不大，當pH大于4時降解率逐漸下降。所以，最佳pH為3.5。pH越大，降解率越低，這主要因為剛果紅是一種酸性染料，pH越大，固定化辣根過氧化物酶對底物的作用能力減弱。

2.3 H2O2濃度對固定化HPR降解染料剛果紅的影響

根據上述試驗方法，使反應保持pH為3.5、反應溫度、反應時間、酶用量等條件同上，考察H2O2濃度對降解率的影響。選取H2O2濃度范圍0.2～2.0 mmol/L，結果如圖5所示。由圖5可知，在H2O2的濃度為1.0 mmol/L時降解率最大，此時降解效果最好，降解率為84.3%，如果H2O2濃度繼續增大，對降解率影響不大，所以最佳H2O2的濃度為1.0 mmol/L。

2.4 反應時間對固定化HPR降解染料剛果紅的影響

緩沖溶液保持pH為3.5，恒溫槽的溫度為40 ℃，氧化劑H2O2的濃度為1.0 mmol/L，底物濃度0.1 mmol/L，選取反應時間5～40 min，考察反應時間對染料脫色降解的影響。從圖6中可以看出，開始反應時隨著時間的延長降解效果越來越好，當反應持續到30 min時降解率達到最大值，此時降解率為85.0%，而當反應繼續進行，降解率基本保持不變，所以最佳反應時間為30 min。

2.5 溫度對固定化HPR降解剛果紅的影響

為了提高降解效率，繼續考察反應溫度對降解率的影響，緩沖溶液保持pH為3.5，氧化劑H2O2的濃度為1.0 mmol/L，底物濃度0.1 mmol/L，反應時間30 min，選取溫度分別為15、20、30、40、50、60、70 ℃，考察反應溫度對剛果紅染料降解率的影響。由圖7可以看出，固定化的HRP在40 ℃時的活性最高，降解率達到89.4%，而隨著溫度的升高，酶活性逐漸下降，導致降解效果變差，所以選取最佳反應溫度為40 ℃。

2.6 染料初始濃度對固定化HPR降解剛果紅的影響

對染料的初始濃度進行考察，保持緩沖溶液的pH為3.5，恒溫槽的溫度為40 ℃，氧化劑H2O2的濃度為1.0 mmol/L，反應時間為30 min，選取不同的底物濃度：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L，考察不同的底物濃度對降解率的影響。由圖8可以看出，不同的底物濃度對降解率影響較大，隨著底物濃度的增大，降解率逐漸減小，本實驗的最佳底物濃度為0.1 mmol/L，降解效率達到91.6%。

通過以上試驗得出降解的最佳條件：pH為3.5，固定化酶用量為0.5 g，過氧化氫濃度為1.0 mmol/L，底物濃度為0.1 mmol/L時，在40 ℃的恒溫槽中加熱反應30 min得到最大降解率為91.6%。

2.7 固定化HPR的最大循環次數

將0.5 g 固定化辣根過氧化物酶和pH為3.5的緩沖溶液加入至200 μL底物濃度為0.1 mmol/L的剛果紅染料液中，最后加入濃度為1.0 mmol/L的H2O2溶液，在40 ℃恒溫槽中降解反應，30 min后反應結束，計算降解率；然后將反應液進行處理，濾去所有液體，剩下固定化的HPR。并用適量的緩沖液洗滌固定化HPR 4～5次，然后加入相同濃度和體積的剛果紅溶液，在相同條件下進行新的實驗，如此重復4次。由圖9可以看出，隨著固定化HPR降解染料次數的增加，染料脫色率逐漸降低。酶重復使用4次后，剛果紅染料的脫色率從91.5%下降至22.0%。

2.8 染料降解產物的質譜分析

為確定降解產物，對剛果紅染料的降解產物進行質譜分析。反應后的混合液用乙酸乙酯萃取3次，有機相合并后旋轉蒸干，用甲醇溶解，質譜分析。結果如圖10所示。在正負不同離子模式下的質譜圖。

據報道，偶氮染料的氧化降解在文獻中提出了2個重要的途徑：一個對稱的偶氮鍵斷裂和一個不對稱的[13，14]偶氮鍵斷裂。Lopez等[15]研究表明，用錳過氧化物酶降解橙黃Ⅱ溶液時2種斷裂方式都存在，所用的分析方法為1H NMR和ESI-MS質譜分析。本實驗采用ESI-MS質譜分析，對降解產物的推測結果表1所示。

根據表1推測了剛果紅降解的一種可能途徑。首先，剛果紅的2個偶氮雙鍵發生斷裂，分解成兩分子的1，8-二氨基-3-萘磺酸鈉和一分子的4，4-二氨基聯苯；接著，分解成的4，4-二氨基聯苯中的氨基也會被氧化成為亞硝基，又生成4，4-二亞硝基聯苯，又被氧化成硝基，生成4，4-二硝基聯苯，如果繼續氧化，可能導致聯苯斷裂，生成苯酚、苯二氮烯等小分子物質。同樣，生成的1，8-二氨基-3-萘磺酸鈉中的氨基被氧化成亞硝基，生成1，8-二亞硝基-3-萘磺酸鈉，亞硝基進一步被氧化成硝基，形成1，8-二硝基-3-萘磺酸鈉。當然，剛果紅分子本身結構較為復雜，并帶有相當多的官能團，因此所推斷的產物可能只是其降解過程中生成產物的一部分。降解過程主要利用電子得失，使不飽和鍵斷開，將大分子的發色基團氧化分解成無色無毒或毒性較小的小分子物質，最終達到降解目的。

3 結論

研究結果表明固定化的辣根過氧化物酶完全可以降解剛果紅染料，而且固定化的辣根過氧化物酶跟辣根過氧化物酶溶液相比，能夠重復使用，這樣不僅可以節約成本，而且可以提高降解率。同時本降解途徑采用的氧化劑為H2O2，符合綠色降解的要求。對降解產物的質譜分析證實了固定化辣根過氧化物酶催化H2O2氧化偶氮染料剛果紅經水解酸化降解成了結構更簡單的中間產物。本研究作為探究性實驗，其主要目的是用于工業廢水的處理，通過實驗說明固定化的辣根過氧化物酶確實可以對染料剛果紅進行降解。

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