麻黃內生真菌的初步研究

于淼等

摘要：從寧夏回族自治區賀蘭山高鹽堿地區采集的麻黃樣本中分離得到7株內生真菌，體外抗氧化活性測定表明，所分離到的內生真菌中有5株具有較高的抑制羥基自由基能力；有5株菌的發酵液具有中等強度的總抗氧化能力。在抗菌活性測定中，所分離到的7株麻黃內生真菌對細菌指示菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現出一定的抑菌作用，但對真菌指示菌炭疽桿菌和黑曲霉均未檢測到抑菌活性。

關鍵詞：麻黃（Ephedra sinica）；內生真菌；抗菌活性；抗氧化活性

中圖分類號：S432 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4482-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.023

自1898年Vogl從黑麥草（Lolium temulentum L.）種子內將第一株內生真菌分離出來至今，已有100多年的歷史，但是最近20年才正式開展藥用植物內生真菌的研究[1]。1993年美國Montana州大學植物病理系博士Stierle等分離紅豆杉韌皮部的內生真菌，得到產生化合產物紫杉醇的內生真菌[2]。該類菌株的發現使得微生物學者的目光都放在植物，特別是藥用植物內生真菌的代謝產物研究上。這類研究使得目前致病菌對抗生素的耐藥性蔓延起到了至關重要的改善作用。

在自然界存在很多極端環境，如高鹽、高堿、高酸、高干旱、高壓以至高濃度重金屬離子和低營養等環境為一般生物生長和存活的極限，但卻能生長著相應的、能適應這些極端環境的植物和微生物。這些生物經長期自然選擇，具備了較強且穩定的特殊結構、機能和遺傳基因，以應答強烈的限制因子[3]。寧夏回族自治區位于西北地區東部、黃河中上游，地處中溫帶半干旱、干旱區，降水稀少（平均年降水量292 mm），蒸發強烈（水面蒸發量1 296 mm），當地水資源總量為1 117億m3，僅占全國水資源總量的0.104%。近年來，引黃灌區的土壤鹽漬化問題受到了寧夏自治區的高度關注，銀川北部地區鹽堿地已占總耕地面積的49%以上[4]。所以，寧夏賀蘭山地區的土地鹽堿化程度高，本試驗選取該地區高鹽堿環境下生長的麻黃作為極端環境下的研究樣本。

木賊麻黃（E.equisetina Bunge）、草麻黃（E.sinica Stapf）和中麻黃（E.intermedia Schrenk ex Mey）主要被《中國藥典》1985年版收載作為藥用的麻黃植物。從麻黃的作用和功效上看，其具有利水消腫、宣肺平喘、發汗散寒等功效，在中醫醫學上受到廣泛地利用[5]。本研究以寧夏回族自治區鹽堿地生長的草麻黃為樣本，對麻黃根、莖、葉分別進行了內生真菌的分離、純化，并對得到的內生真菌進行了抗菌活性、抗氧化活性的測定。對極端環境下藥用植物內生真菌的研究，探討在外界惡劣環境下，植物與內生真菌之間協同抵御環境影響的關系，并期望從中分離篩選出具有高生物活性的內生真菌菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

選取寧夏回族自治區銀川市賀蘭山區采集的麻黃。采集時間為2014年4～5月。采集麻黃新鮮枝葉，以體積分數為75%乙醇擦拭表面后裝入保鮮袋，4 ℃封存。

1.2 指示菌

抗菌試驗指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphalococcus aureus）、炭疽桿菌（Bacillus anthraci）、黑曲霉（Aspergillus niger），均為本實驗室保存菌懸液。

1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，加去離子水煮沸30 min，8層紗布過濾，濾液加入葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL，并加入2%～2.5%的瓊脂制成固體培養基。121 ℃高壓滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB）：去皮馬鈴薯200 g，加去離子水煮沸30 min，8層紗布過濾，濾液加入葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL。121 ℃高壓滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨培養基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，加入去離子水定容至1 000 mL，校正pH至7.2～7.4。121 ℃高壓滅菌30 min。

1.4 儀器與設備

ZSD-1160全自動新型生化培養箱、KYC-11021C恒溫培養搖床、臺式高速冷卻離心機、T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、Multicontrol12L/18L型高壓滅菌鍋、PB303-E電子天平（METTLER-TOLEDO儀器公司）、北京長源水浴控溫儀（北京長源實驗設備廠）、R201D-11旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、超凈工作臺、試管、燒杯、錐形瓶。

2 試驗方法

2.1 內生真菌的分離

試驗方法參照文獻[6～9]，將采集來的麻黃置于水槽中用流動水沖洗5 min，將麻黃置于濾紙上自然風干。將風干的麻黃分為根、莖、葉三部分，分別剪成大小為2～3 cm的組織塊，在超凈工作臺再將樣品剪成0.5 cm×0.5 cm大小，并用體積分數為75%的乙醇浸泡1 min，去離子水漂洗2次；在2.5%的次氯酸溶液中浸泡2 min，去離子水漂洗3次。置于濾紙上風干后，接種于含有磷酸慶大霉素的PDA培養基中（每皿3～4個組織塊）。置于恒溫培養箱中，28～30 ℃培養5～7 d，12 h觀察一次，48 h內長出的菌絲，均用無菌解剖刀連培養基切去。48 h后，將組織塊邊緣菌絲挑至另外PDA斜面進行分離培養，保種。

2.2 內生真菌的純化

將分離出的菌種再次進行恒溫培養（此次培養基中不加磷酸慶大霉素），28～30 ℃培養5～7 d，48 h后將長出的菌落邊緣菌絲挑至新配制的PDA培養基中。進行3～4次重復培養。培養完成后將菌種挑至斜面進行保種。

2.3 內生真菌的發酵

將上述經純化的內生真菌接種于PDA培養基中活化（28～30 ℃），5 d后配制液體培養基PDB，將經活化的內生真菌單個菌落的1/4用無菌解剖刀連培養基切下，放入PDB中，置于恒溫搖床進行發酵。發酵時間為14 d。發酵結束后，將發酵液經8層紗布過濾，以8 000 r/min速度離心10 min。離心結束后，取上清液進行旋蒸，冷卻至室溫后置于洗凈的錐形瓶中，4 ℃保存備用。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 抑制羥自由基能力測定 根據Fenton反應測定樣品對羥自由基的抑制作用。采用南京建成公司生產的羥自由基測定試劑盒（貨號：A018 50T/48樣），依據其說明配制應用液。應用液在37 ℃水浴中預溫3 min，并在水浴鍋中完成空白管、標準管、對照管和測定管的添加工作?；靹?，37 ℃反應1 min（以秒表計時），加入顯色劑終止反應，一次做一支試管。再次混勻后室溫放置20 min，而后以波長550 nm，1 cm光徑，去離子水調零，測定各管的吸光值。

抑制羥自由基能力（U/mL）

=■×標準品濃度（8.824 mmol/L）×■×樣本測試前稀釋倍數。

2.4.2 總抗氧化活性測定 機體中有許多抗氧化物質，能將Fe3+還原成為Fe2+，后者可與斐林類物質形成穩固的絡合物。采用南京建成公司生產的總抗氧化（T-AOC）測定試劑盒，依據說明書配制應用液。按要求加入相應的應用液，充分混勻后，37 ℃水浴30 min，向測定管和對照管中加入內生真菌發酵液。再次混勻后放置10 min，而后以波長520 nm，1 cm光徑，去離子水調零，測定各管的吸光值。

總抗氧化能力（U/mL）=

■×■×樣本測試前稀釋倍數。

2.5 抗菌活性的測定

取濾紙，用打孔器將濾紙打成直徑約0.5 cm的濾紙片，經高壓滅菌鍋滅菌后備用。取本實驗室保存的指示菌大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、炭疽桿菌（Bacillus anthraci）、黑曲霉（Aspergillus nige）進行活化培養，將經活化的指示菌接種于培養基中，并在接種位置附近放置經內生真菌發酵液浸泡的濾紙片。恒溫培養24 h后，測量濾紙片邊緣產生的抑菌圈大小。

3 結果與分析

3.1 麻黃內生真菌的分離

用組織切片培養法從麻黃組織的葉片內、莖和根部中共分離得到7株內生真菌，其中葉片內分離出2株、莖4株、根部1株。本試驗分離到的麻黃內生真菌數量較少，可能是由于麻黃生長環境特殊所致；也可能是由于前期植物樣品經消毒、滅菌的時間長、過于徹底導致。

3.1 抗氧化活性測定

3.1.1 抑制羥基自由基能力 經羥基自由基測定試劑盒測定，7株麻黃內生真菌發酵液經稀釋20倍后抑制羥基自由基的能力如表1所示。

用相同方法測得維生素C的抑制羥基自由基能力為908.47 U/mL。與維生素C的抑制羥基自由基能力相比較，7種內生真菌發酵液中，除3號和6號抑制羥基自由基能力弱以外，其余5株麻黃內生真菌發酵液均具有較高的抑制羥基自由基能力。

3.1.2 總抗氧化測定 經總抗氧化（T-AOC）測定試劑盒測定，7株麻黃內生真菌發酵液總抗氧化能力如表2所示。

用相同方法計算維生素C的總抗氧化能力為43.78 U/mL。由表2可知，7種內生真菌發酵液中，2號和6號菌株發酵液的總抗氧化能力較弱，其余5株麻黃內生真菌具有中等強度的總抗氧化活性。

3.2 抗菌活性測定

以金黃色葡萄球菌（SA）、大腸桿菌（EC）、炭疽桿菌（BA）、黑曲霉（AN）作為指示菌，采用濾紙片法對分離的7株麻黃內生真菌進行抗菌活性測定。抑菌結果見表3。

由表3可知，在7株供試菌中，對細菌類的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，但對真菌類的炭疽桿菌和黑曲霉均無抑菌作用。其中有5株對金黃色葡萄球菌顯示出了較強的抗菌活性。

4 小結與討論

中國中草藥資源豐富，使用年代久遠，中草藥是具有價值的藥用資源[10]。麻黃作為一種傳統的中藥材在民間和中醫中廣泛采用。本研究選取寧夏回族自治區賀蘭山鹽堿化較重地區生長的麻黃作為試驗材料，分離得到7株內生真菌。在麻黃內生真菌的抗氧化活性測定中，選取抗氧化活性較強的維生素C作為陽性對比，有5株顯示出中等強度的總抗氧化活性，5株顯示出較強抑制羥自由基能力。樣品的抗菌活性分析中，濾紙片法測定結果顯示，各株麻黃內生真菌對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等細菌具有一定的抑菌活性，但對炭疽桿菌和黑曲霉等真菌無抑菌作用。

本研究對寧夏回族自治區鹽堿化地區生長的藥用植物麻黃進行了內生真菌的初步分離，并對其生物活性進行了初步探討，為藥用植物內生真菌的研究添加了植物樣本。同時，對內生真菌生物活性研究為從特殊生境的藥用植物中得到結構新穎的藥物先導化合物奠定了基礎，對藥用植物的保護與合理開發利用意義重大。

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