家蠶黑胸敗血病病原菌的分離鑒定

覃玥等

摘要：從廣西宜州蠶區暴發黑胸敗血病的養蠶農戶處采集到病蠶樣本，分離到1株病原菌，通過形態學觀察和回復感染健康5齡家蠶試驗及16S rDNA基因序列同源性分析鑒定，結果顯示病原菌菌落呈橘黃色，光滑，圓形，邊緣整齊，有光澤，濕潤有黏性，革蘭氏染色呈陽性，該菌形態學符合葡萄球菌屬的特征；用菌液穿刺感染健康5齡家蠶10 h后蠶體胸部膨大，痙攣側倒而死，11 h后胸部變黑呈現黑胸敗血病病癥；從腹腔接種菌液的小白鼠16 h內全部發病，從發病的家蠶體液和死亡小鼠的心血均能分離到與接種菌株形態一致的細菌，證實該菌為引起家蠶黑胸敗血病的病原菌。菌株16S rDNA片段為1 463 bp（GenBank ID：1811543），與GenBank數據進行比較，該菌株與松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）同源性為99.9%，鑒定該菌株為松鼠葡萄球菌。

關鍵詞：家蠶細菌病；黑胸敗血病；松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）；16Sr DNA；分子鑒定

中圖分類號：S884.4+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4529-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.034

細菌病是養蠶生產中最常見的病害，研究發現對家蠶有致病性的病原細菌主要有葡萄球菌屬（Staphylococcus）、沙雷氏菌屬（SerratiaBizio）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、腸桿菌屬（Enterobacter Hormaeche and Edwards）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）[1]。黑胸敗血病是常見的家蠶細菌病之一，文獻報道其病原主要是芽孢桿菌屬，發病典型癥狀是在胸部背面或胸腹之間出現黑色斑，很快全身變黑腐爛。廣西宜州市是中國最大的桑蠶生產地，多批次養蠶模式及高溫多濕的氣候使蠶病的發生非常嚴重，蠶農防治家蠶細菌病主要使用抗生素類藥物，抗生素的不科學使用容易造成家蠶病原菌耐藥性增強，導致耐藥菌株產生[2]，對桑蠶業的健康發展造成很大的威脅，同時細菌在生長繁殖過程中發生諸如大小改變、結構變化及毒力增強或減弱等的變異現象。2012年6月，宜州市某養蠶戶2張5齡第四天蠶暴發細菌病，發病率高達40%，從發病癥狀判斷為家蠶黑胸敗血病，為了明確引起該例家蠶黑胸敗血病的病原及其特性，采集了家蠶黑胸敗血病蠶樣并分離其病原菌進行形態學觀察、革蘭氏染色、回復感染健康5齡家蠶試驗及分子生物學鑒定，旨在明確其病原菌的分類地位和特性，為蠶病的防控、蠶藥的合理使用及新藥研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶

家蠶黑胸敗血病樣本從廣西宜州市某農戶家采集，表現為側倒死亡，胸部背面和胸腹之間出現黑色斑；健康5齡家蠶是兩廣2號，河池學院桑蠶研究所提供；昆明種小白鼠購自廣西醫科大學實驗動物中心，每只體重約20 g。

1.2 試劑

PCR反應試劑、Marker、連接酶、限制性內切酶等均購自TaKaRa公司。

1.3 病原菌的分離純化

用75%乙醇對病蠶體表消毒，刺破體壁取體液，用無菌水稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨培養基，30 ℃培養16 h，挑取單個優勢菌落進一步純化培養，觀察菌落形態特征，并進行革蘭氏染色，觀察細菌的形態和染色結果[3，4]。

1.4 細菌回復感染蠶體試驗和病原菌致病力的檢測

分離菌株編號為Cqy201201，將其接種于細菌培養基，30 ℃振蕩培養16 h，用分光光度計測菌液濃度，取1.62×106 CFU/mL的半數致死量菌液回復穿刺健康5齡家蠶體壁作回歸試驗，取60只健康5齡家蠶，均分成甲、乙兩組，甲組每只蠶從體壁注射接種2 μL菌液，乙組注射無菌生理鹽水作對照，接種后兩組均投桑葉置于28 ℃飼養。取健康小白鼠12只平均分成2組，其中1組為感染組，每只小白鼠腹腔接種0.1 mL菌液，對照組每只小白鼠腹腔注射0.1 mL無菌生理鹽水。觀察、記錄家蠶和小白鼠發病情況及死亡時間[5]，并對瀕死的家蠶和試驗鼠進行細菌分離、培養和鑒定。

1.5 細菌的16S rDNA基因擴增鑒定

用DNA抽提試劑盒提取細菌基因組DNA作為PCR模板擴增16S rDNA序列，參照文獻[5]設計細菌16S rDNA通用引物，上游引物16SF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物16SR：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，反應體系為：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL， 10 μmol/L 16SF 1 μL，10 μmol/L 16SR 1 μL，基因組DNA（20～50 ng/μL）1 μL，加9.5 μL ddH2O至總體積為25 μL；反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 30個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應 。取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI進行Blast比對鑒定菌株。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學特征

從表現家蠶黑胸敗血病的家蠶體液中分離純化的菌株（編號為Cqy201201）菌落呈圓形、黃色、光滑、不透明、邊緣整齊、有光澤、濕潤有黏性等特征，色素不擴散到培養基中（圖1），革蘭氏染色呈陽性（圖2），無芽孢，無莢膜，不運動，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版描述的菌落形態特征，該菌形態學符合葡萄球菌屬的特征。

2.2 細菌回復感染和致病性測定

用Cqy201201菌液通過穿刺感染健康5齡家蠶6 h后，試驗組家蠶開始停食，軀體挺直，行動呆滯，頭尾翹起，腹部向腹面拱出，腹足后傾，隨著時間的推移，胸部開始膨大，蠶體的病癥逐漸加重，10 h后，腹部各環節收縮，痙攣側倒而死，11 h后蠶體胸部出現黑色斑，13 h后蠶體全身變黑（圖3），該癥狀與蠶農家采集到的黑胸敗血病蠶體癥狀相同，對照組則無異常。從腹腔接種0.1 mL菌液的小白鼠16 h內全部發病，表現昏睡、眼流淚等癥狀，24 h后全部死亡，對照組小白鼠48 h無發病，從發病的家蠶體液和死亡小鼠的心血和肝臟均能分離到與接種菌株形態一致的細菌，說明該菌為引起家蠶黑胸敗血病的病原菌。

2.3 PCR擴增16S rDNA序列分析結果

以菌株基因組DNA為模板，用16S rDNA基因通用引物16SF/16SR擴增得到Cqy201201菌株16S rDNA片段， PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳，呈現約1.5 kb的條帶（圖4），與預期結果相符，測序結果為1 463 bp（GenBank ID：1811543），將菌株Cqy201201的16S rDNA序列在GenBank數據庫中進行Blast相似性搜索，其序列同源性最為接近的菌株均為葡萄球菌屬，與松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）16S rDNA基因序列有高達99.9%的同源性，表明Cqy201201為松鼠葡萄球菌屬。

3 討論

本研究從出現黑胸敗血病較為嚴重的農戶家的病蠶體分離到1株松鼠葡萄球菌，人工感染試驗證實其對健康5齡家蠶和小白鼠均有較強的致病性，并表現出與自然感染相似的臨床癥狀與病理變化，而且從人工感染的病死蠶和小鼠體內再次分離到與原致病菌株形態特征一致的單一菌株，由此證實菌株Cqy201201是該病的致病菌株。對Cqy201201進行了16S rDNA的克隆與序列分析，結果顯示Cqy201201與S.sciuri代表株CTSP9 16S rDNA序列的同源性最高，為99.9%，因此可從分子水平上將菌株Cqy201201鑒定為松鼠葡萄球菌。

松鼠葡萄球菌屬是葡萄球菌科的成員之一，Kloos等[6]1976年首次報道，為條件性致病細菌，該菌能夠引起黃鱔魚[7]、黃喉擬水龜[8]等多種動物的急性傳染病，發生大批量的死亡，造成養殖戶巨大的經濟損失，也有引起山羊和奶牛乳房炎，豬滲出性皮炎等動物疾病的報道[9，10]。松鼠葡萄球菌也是外傷感染的主要病原，能引起人的心內膜炎、腹膜炎、敗血癥、尿道感染、盆腔炎癥和傷口感染等多種疾病[11-14]，研究發現ExhC是松鼠葡萄球菌致病機理中的關鍵因素之一。松鼠葡萄球菌引起家蠶黑胸敗血病尚未見報道，一直認為引起家蠶黑胸敗血病主要病原是芽孢桿菌[15，16]，從發病到死亡約12～20 h，死后3～4 h出現黑斑。本試驗分離到的松鼠葡萄球菌引起黑胸敗血病的家蠶從發病到死亡約為11 h，死后2 h出現黑斑，生產上更容易造成家蠶大批量死亡，說明該菌具有較強的致病能力。

松鼠葡萄球菌病是一種環境性致病菌，控制和防范措施主要是防止及減少家蠶外傷的發生，注意做好養蠶前的消毒工作。在明確廣西宜州市蠶區家蠶黑胸敗血病的病原菌特征后，進一步的工作是研究蠶藥及中草藥對該菌的防治效果，科學合理地防治該病的發生，控制家蠶細菌病病害流行和蔓延。

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