一株產(chǎn)α—淀粉酶嗜熱菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

呂美云等

摘要：從江西省宜春市溫湯鎮(zhèn)溫泉水域中篩選出35株產(chǎn)α-淀粉酶嗜熱菌株，選取一株產(chǎn)α-淀粉酶活力較高的嗜熱菌YC-15為出發(fā)菌株，對其進行16S rRNA基因序列分析。結(jié)果表明，YC-15與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的16S rRNA序列相似性達98%，結(jié)合其形態(tài)、生理生化特征，進一步證明了YC-15在分類上應(yīng)歸屬枯草芽孢桿菌。并對YC-15產(chǎn)酶條件進行了研究，其最佳碳源為2%可溶性淀粉，最佳氮源為0.5%酵母膏+0.5%蛋白胨，最適產(chǎn)酶初始pH為7.0，最適產(chǎn)酶溫度55 ℃，屬中性嗜熱產(chǎn)α-淀粉酶菌。

關(guān)鍵詞：嗜熱菌；α-淀粉酶； 鑒定； 產(chǎn)酶條件

中圖分類號：Q939.124；TS261.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4573-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.046

α-淀粉酶是將淀粉分子內(nèi)部α-1，4糖苷鍵切開，生成糊精和還原糖，因為產(chǎn)物的末端殘基碳原子構(gòu)型為α構(gòu)型，故稱α-淀粉酶。α-淀粉酶是商品化生產(chǎn)最早、應(yīng)用最早、應(yīng)用范圍最廣和用量最大的工業(yè)酶類之一，它廣泛應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)[1]。α-淀粉酶約占工業(yè)酶市場的30%[2]。在工業(yè)生產(chǎn)中，不同的生產(chǎn)工藝，對α-淀粉酶要求不同，在造紙工業(yè)與面包焙烤工業(yè)中，需要中溫下熱穩(wěn)定性好的α-淀粉酶，而釀酒時，需要高溫下熱穩(wěn)定性好的α-淀粉酶。因此，隨著α-淀粉酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大， 開發(fā)篩選具有各種特性的α-淀粉酶成為目前酶制劑研究領(lǐng)域的一個重要方向。

張繼千等[3]從威海文登海域篩選到一株產(chǎn)中溫淀粉酶的海洋菌W11，初步鑒定為弧菌；權(quán)淑靜等[4]從釀造大曲中篩選到一株產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株，鑒定為黑曲霉；胡建恩等[5]從海底熱液口獲得了一株耐高溫α-淀粉酶，命名為超嗜熱古菌HJ21，耐高溫α-淀粉酶的最適作用溫度為95 ℃。高溫菌，又稱嗜熱菌，是指能在高溫（60 ℃）環(huán)境中生長和繁殖的極端環(huán)境微生物，主要包括部分細菌、古菌和真菌，嗜熱菌的耐熱性及其產(chǎn)生的相關(guān)耐熱酶對很多工業(yè)有相當大的潛在價值，因而備受關(guān)注。江西宜春溫泉有著良好的地?zé)豳Y源，水溫常年保持在68～72 ℃，可為嗜熱菌提供生長環(huán)境。目前關(guān)于宜春溫泉菌的研究鮮有報道，本研究選取一株產(chǎn)α-淀粉酶的嗜熱菌菌株YC-15為出發(fā)菌株，對其進行形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S rRNA 基因序列分析，并優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，旨在為豐富產(chǎn)淀粉酶菌種資源和進一步挖掘該菌株的應(yīng)用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 從江西省宜春市溫湯鎮(zhèn)溫泉古井采樣點1處（溫度68 ℃，pH 6.5～6.7）和宰殺禽類溫泉水池采樣點2處（溫度65 ℃，pH 6.2～6.5）分別采樣。常溫運輸， 實驗室4 ℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基；α-淀粉酶選擇培養(yǎng)基[6]：淀粉10 g，NH4H2PO4 5 g，酵母膏1 g，K2HPO4 0.1 g，MgSO4 0.1 g，檸檬酸三鈉 0.5 g， MnSO4 0.1 g，F(xiàn)eSO4 0.1 g，CaCl2 0.2 g，pH 7.2，固體培養(yǎng)基中添加瓊脂22 g；種子培養(yǎng)基[7]：可溶性淀粉2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[7]：可溶性淀粉2.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO4 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，MgSO4.7H2O 0.05%， FeSO4·7H2O 0.005%，pH 7.0。

1.1.3 主要試劑 博彩生物Taq DNA polymerase、MgCl2、Buffer for Taq DNA polymerase、Fast DL 2000 ladder瓊脂糖（上海藍季科技發(fā)展有限公司）；PCR純化試劑盒[康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司]。

1.1.4 主要儀器 DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），ZF-90型暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠），GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），TC-XP-G型梯度PCR儀（杭州博日科技有限公司），722型可見光分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選 取2處水樣放入88 ℃恒溫水浴鍋中處理15 min，取1 mL處理過的樣品接種到已滅菌的50 mL牛肉膏蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，55 ℃搖床培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液稀釋5個梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別取每一濃度0.1 mL 涂布于α-淀粉酶選擇培養(yǎng)基上，置于55 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落形成，將其放置4 ℃冰箱5 h，觀察菌落形狀、大小和菌落周圍透明圈。挑取有透明圈菌株，采用常規(guī)的稀釋涂布法進行菌株的分離和純化，滴加路戈氏碘液，觀察各菌株產(chǎn)透明圈情況，選取d0/d1（d0為水解圈直徑，d1為菌落直徑）最大的為本試驗出發(fā)菌株。

1.2.2 菌株發(fā)酵 將出發(fā)菌株接種于種子液培養(yǎng)基搖瓶12 h，2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，55 ℃下?lián)u床180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.3 粗酶液的制備 菌株發(fā)酵完成后，經(jīng)過8 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.4 α-淀粉酶活力測定 用姜永明等[8]改良法：取5 mL 0.5%的可溶性淀粉溶液，在40 ℃水浴中預(yù)熱10 min，然后加適當稀釋的酶液0.5 mL，反應(yīng)5 min后，用5 mL 0.1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。取0.5 mL反應(yīng)液與5 mL稀碘液顯色，在620 nm處測光密度。以0.5 mL水代替0.5 mL反應(yīng)液為空白，以不加酶液（加檸檬酸緩沖液pH 6.0）為對照。計算公式：酶活力=（R0-R）/R0×50×D，其中R0、R分別表示對照和反應(yīng)液的光密度，D為酶稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使（R0-R）/R0在0.2～0.7。酶活力單位定義：在40 ℃，5 min內(nèi)水解1 mg淀粉的酶量為一個活力單位。

1.2.5 菌種鑒定方法 常規(guī)鑒定參見文獻[9]、[10]；分子鑒定參見文獻[11]中的方法進行。

1.2.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 以單因素試驗考察碳源、氮源、初始pH、發(fā)酵溫度等條件，按2%的接種量接種，180 r/min水浴培養(yǎng)后，測定粗酶液酶活力，確定目標菌株最佳發(fā)酵碳源、氮源、初始pH、發(fā)酵最佳溫度。

1.2.7 菌種YC-15總DNA的提取與檢測 取1.5 mL培養(yǎng)液于EP管中，13 000 r/min離心5 min，棄上清液。向沉淀物中加入1 mL get緩沖液，冰上放置3 min，13 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入0.6 mL TE緩沖液制成懸濁液。向懸濁液中加入60 μL 1%SDS劇烈振蕩。放入65 ℃水浴30 min溶液變性。加入等體積Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），振蕩10 min離心15 min保留上清液。加入等體積飽和酚再抽提1次，取上清液。向上清液中加入1/10體積3 mol/L NaAc。加入等體積異丙醇，離心10 min棄上清液。用70%乙醇洗滌，留沉淀，加入80 μL TE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.8 16S rDNA PCR擴增、序列測定及分子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以提取YC-15菌株總DNA 為模板， 對16S rDNA基因序列進行PCR 擴增。引物序列：27F：（5-ATTCCGGTTGATCCTGC-3）和1541R：（5-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）。PCR 采用50 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性4 min ，94 ℃變性1 min ，退火溫度設(shè)置（58、57.4、56.4、54.9、53.1、51.5、50.5、50.0 ℃）8個梯度40 s ，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；72 ℃保持10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增結(jié)果， 并通過PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進行純化。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進行測序，測得的ITS序列在GenBank中進行BLAST，應(yīng)用MEGA6.0軟件中鄰接法（Neighbour-joining methods，NJ）構(gòu)建聚類分析樹狀圖，bootstrap檢驗值≥50%，1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)α-淀粉酶的嗜熱菌株的篩選

將宜春溫泉采集到的水樣富集，以梯度稀釋涂布于α-淀粉酶選擇培養(yǎng)基平板，置于55 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落形成，將其放置4 ℃冰箱5 h，觀察菌落周圍透明圈，初步確定為產(chǎn)α-淀粉酶嗜熱菌株。再將菌株以稀釋平板法進一步分離純化。滴加路戈氏碘液，測定淀粉水解圈大小，選取d0 /d1最大的YC-15作為本試驗出發(fā)菌株（表1）。

2.2 產(chǎn)α-淀粉酶菌株YC-15的鑒定

2.2.1 菌株YC-15形態(tài)觀察 YC-15菌落在平板上產(chǎn)生的透明水解圈（圖1）。菌落圓形較大，邊緣較平滑，略有小齒，表面褶皺干燥，乳白色。光學(xué)顯微鏡下可以觀察到菌株為短桿菌，中生芽孢（圖2）。

2.2.2 菌株YC-15生理生化測定 對菌株YC-15進行了鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征（表2），初步鑒定YC-15菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 菌株YC-15總DNA和16S rDNA的電泳

產(chǎn)淀粉酶的嗜熱菌株YC-15總基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖3，提取的16S rDNA-PCR顯示在2 000 bp附近出現(xiàn)了清晰的條帶，測序結(jié)果表明，PCR擴增得到的16S rDNA區(qū)域的目的片段大小為1 454 bp。16S rDNA電泳如圖4所示。

2.4 菌株YC-15 16S rRNA序列分析

基于菌株16S rRNA序列采用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹以確證YC-15菌株的分類歸屬（圖5），菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的16S rRNA序列相似性達98%，可以看出YC-15菌株應(yīng)歸為枯草芽孢桿菌。

2.5 菌株YC-15產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.5.1 YC-15菌株生長曲線 由圖6中生長曲線與相應(yīng)時間產(chǎn)酶曲線可知，4～14 h為YC-15菌株對數(shù)生長期，16 h后菌體生長進入穩(wěn)定期；而α-淀粉酶活力在培養(yǎng)12 h后開始迅速增加，32 h時α-淀粉酶酶活力達到最高，隨后酶活力開始降低。

2.5.2 碳源對菌株YC-15產(chǎn)酶能力的影響 以蛋白胨為氮源，改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類，配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基。121 ℃滅菌20 min。以250 mL三角瓶裝液50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按0.5%的接種量接種，55 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)32 h后測定粗酶液酶活力（圖7）。由圖7可知，以淀粉為碳源時酶活力最高。

2.5.3 氮源對菌株YC-15產(chǎn)酶能力的影響 以淀粉為碳源，改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的種類，配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基（圖8）。由圖8可知，以0.5%酵母膏+0.5%蛋白胨為氮源產(chǎn)酶能力最強。

2.5.4 培養(yǎng)基初始pH對菌株YC-15產(chǎn)酶能力的影響 以淀粉為碳源、0.5%酵母膏+0.5%蛋白胨為氮源，改變發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH，55 ℃溫度下180 r/min搖床培養(yǎng)32 h（圖9）。由圖9可知，培養(yǎng)基初始pH為7時菌株產(chǎn)酶能力最強，而在pH 5～9酶活力相對穩(wěn)定。

2.5.5 培養(yǎng)溫度對菌株YC-15產(chǎn)酶能力的影響 將已優(yōu)化碳源、氮源、初始pH的發(fā)酵培養(yǎng)基在9個溫度下180 r/min搖床培養(yǎng)32 h（圖10）。由圖10可知，經(jīng)過酶活力測定得知55 ℃培養(yǎng)時菌株產(chǎn)酶能力最強。在50～60 ℃酶活力較穩(wěn)定，在90 ℃時的酶活力可達最大值的50%。

3 結(jié)論

本研究系宜春市溫湯鎮(zhèn)溫泉水域中篩選得到的一株產(chǎn)α-淀粉酶菌株YC-15，通過對其16S rRNA 基因序列分析，結(jié)果顯示，YC-15與枯草芽孢桿菌的16S rRNA 序列相似性達98%，結(jié)合其形態(tài)、生理生化特征，進一步證明了YC-15在分類上應(yīng)歸屬枯草芽孢桿菌。并對YC-15生長和產(chǎn)酶條件進行了研究，結(jié)果表明，4～14 h 為YC-15菌株對數(shù)生長期，最佳碳源2%可溶性淀粉，最佳氮源0.5%酵母膏+0.5%蛋白胨，最適產(chǎn)酶初始pH為7.0，pH 5～9酶活力相對穩(wěn)定，最適產(chǎn)酶溫度55 ℃，在90 ℃時的酶活力可達最大值的50%，由此可見，菌株pH適用范圍廣，具有一定的耐熱性，有望進一步誘變，增強菌株對熱穩(wěn)定性和提高產(chǎn)酶能力，實現(xiàn)高溫發(fā)酵，以應(yīng)用于淀粉加工、酒精、味精、啤酒、有機酸和飼料等行業(yè)。

參考文獻：

[1] PANDEY A， NIGAM P，SOCCOL C R，et al. Advances in microbial amylases[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，2000，31：135.

[2] SHIVRAMAKRISHNAN S，GANGADHARAN D，NAMPOOTHIRI KM et al. Amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J]. Food Technol Biotechnol，2006，44：173-84.

[3] 張繼千，吳 波，鄭冰心，等.海洋菌W11產(chǎn)中溫淀粉酶的酶學(xué)特性[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（1）：71-74.

[4] 權(quán)淑靜，解復(fù)紅，馬 煥，等.一株產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（2）：103-105.

[5] 胡建恩，曹 茜，楊 帆，等.耐高溫α-淀粉酶高密度高表達發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2012，33（1）：219-225.

[6] 楊國俊，黃日波.產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶中度嗜熱細菌的分離、篩選及培養(yǎng)[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995（3）：243-247.

[7] 徐 穎，劉 琦，王 樂，等.一株耐高溫淀粉酶生產(chǎn)菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].四川大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008， 45（4）：991-996.

[8] 姜永明，史永旭，隋德新.枯草芽孢桿菌86315 α-淀粉酶的研究Ⅱ：分離提純、性質(zhì)及動力學(xué)[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1992，13（2）：47.

[9] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].第八版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[10] 沈 萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2007.

[11] 魏 群.分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2011.