西瓜離體組織培養再生體系的研究進展

牛美麗++黨選民++賀滉++詹園鳳

摘 要 闡述了西瓜離體組織培養再生體系建立過程中的一些重要影響因素，如苗齡、基因型、外植體等方面，探討其存在的問題，并對西瓜再生體系的未來進行展望。

關鍵詞 西瓜 ；離體組織培養 ；再生體系

分類號 S651

Research Progress of in Vitro Regeneration System of Watermelon

NIU Meili1） DANG Xuanmin2） HE Huang2） ZHAN Yuanfeng2）

（1 College of agriculture Hainan University， Haikou， Hainan 570208；

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract This paper expounds some important factors of the regeneration system of the tissue culture of the watermelon including seedling age， genotype， and explants， discusses some problems， and looks forward to the establishment of regeneration system of watermelon in the future.

Keywords watermelon ； tissue culture ； regeneration system

西瓜[Citrullus lanatus （Thunberg） Matsumura et Nakai]屬葫蘆科（Cucurbitaceae）雙子葉開花植物，是我國重要的水果類經濟作物，為了滿足廣大消費者的需求，西瓜育種技術也在不斷創新。近年來，隨著植物基因工程技術的迅速發展，利用轉基因技術進行種質創新，培育優質、高產的抗病新品種成為西瓜遺傳育種研究的熱點。西瓜離體高效組培再生體系的建立是轉基因成功的關鍵。1971年Andrus[1]首次報道，成功建立了無籽西瓜的無性繁殖體系，隨后許多學者相繼做了大量的研究[2-4]。

西瓜離體培養的基本原理是利用植物的再生能力及植物細胞的全能性。與大多數植物相比，西瓜的再生能力較弱，不易通過愈傷組織途徑形成再生植株，而且玻璃化現象嚴重，移栽不易成活。因此，加強西瓜高效組織培養的研究，有助于提高轉基因技術在西瓜育種方面的應用。筆者對目前西瓜離體培養再生體系的研究現狀進行綜述，為進一步完善西瓜再生體系提供理論基礎。

1 影響西瓜離體培養再生體系建立的因素

1.1 苗齡

苗齡對于不定芽誘導率的影響較大，苗齡的不同決定著外植體生理狀態的不同。Tabei[5]、Dong[6]和Compton[7]等認為，苗齡為5 d的幼苗子葉的不定芽誘導頻率最高；馬國斌等[8]認為，不同苗齡子葉的不定芽分化率有明顯差異，2 d苗齡子葉的不定芽分化頻率最高，這與王春霞等[9]的報道一致；任春梅等[10]的研究認為，剛剛由黃轉綠的苗齡（4～5 d）的子葉誘導產生不定芽的頻率最高，而苗齡為8～9 d的子葉誘導產生的不定芽最多；Chaturvedi等[11]則認為，7 d苗齡的子葉誘導率最高；趙彩萍等[12]認為，4～6 d苗齡子葉誘導不定芽的效率較高；袁建民[13]的研究認為，苗齡為3～5 d的子葉不定芽誘導率最高，超過5 d不定芽誘導率隨之下降，10 d以上苗齡的子葉不能誘導產生不定芽；肖守華等[14]同樣認為，西瓜苗齡為3～5 d子葉不定芽誘導率維持在較高水平，而且觀察到此時子葉顏色由淡黃色轉為淺綠色，隨著子葉顏色加深，誘導率下降。因此，在西瓜離體培養中，一般多采用4～5 d苗齡的無菌苗子葉作為外植體。但是，由于不同品種的種子發育快慢存在差異，以培養的天數來確定苗齡并不合適，而以子葉顏色判斷可能更加有效，無菌苗子葉呈現淡綠色時不定芽誘導率最高，這在黃學森[15]、任春梅[10]、王果萍[16]及袁建民[13]等學者的研究中都有報道。

1.2 基因型

基因型是影響植株再生的內因。選用合適的基因型材料是西瓜組織培養成功與高效的關鍵，不同的基因型材料誘導分化率有很大差別[4]。一些研究發現，不定芽的誘導不僅受植物激素的影響，而且跟外植體的基因型有關[4，13，17-20]。如鄭先波[21]報道，基因型與愈傷組織誘導關系密切，品種黑蜜5號是最易產生愈傷組織的基因型；董焱等[22]則認為，以未成熟胚為外植體建立的西瓜再生體系對基因型的依賴性不強，如果以未成熟胚為遺傳轉化的受體，有望克服其品種局限性。

1.3 外植體

可以作為西瓜離體再生的外植體種類很多，如頂芽、體胚、真葉、子葉塊、莖尖及下胚軸等，但即使是源自于同一植株的不同外植體類型，其誘導頻率也不相同[23]。任春梅[10]、萬勇[24]等認為，頂芽誘導不定芽的誘導率高于子葉；張志忠等[25]則認為，莖尖和子葉塊是誘導不定芽較好的外植體；張全美[26]采用子葉近胚軸端（帶1 mm下胚軸）誘導西瓜不定芽，其誘導率達到100%，遠高于遠胚軸端，這與Compton[27]和王果萍[16]的研究結果一致；袁建民[13]的研究也認為，子葉近胚軸端是不定芽誘導的最佳外植體。外植體的發育時期也會影響西瓜的再生能力。Compton等[28]用西瓜未成熟胚的子葉作外植體得到了體細胞胚胎，但是他們同時用成熟子葉作外植體進行研究時，就沒有得到體細胞胚胎或者不定芽。這說明未成熟胚的子葉再生能力更強。目前大多數研究者在組織培養過程中采用最多的是子葉作為外植體。

目前，針對外植體接種方式對不定芽誘導影響的研究也相對比較少。商麗敏[23]將外植體分別以近軸端和遠軸端2種方式接種在芽誘導最適培養基上，研究發現，無論以哪種方式將外植體接種在培養基上，不定芽產生的部位總是局限于近軸端；其他學者也有類似報道[7，20，29]。

1.4 激素濃度配比

生長調節物質的濃度及配比，是調控植物器官產生愈傷組織和叢生芽的主導因素。因此，培養基中激素的種類、濃度與組合對愈傷組織及叢生芽的形成起著至關重要的作用[30]。在西瓜的離體培養中，多數選擇從子葉或下胚軸直接誘導芽分化途徑，可以獲得很高的分化率。在培養基中加入細胞分裂素的目的，主要是促進細胞分裂和分化不定芽，生長素被用于誘導細胞的分裂。

1.4.1 激素濃度配比對愈傷組織的誘導影響

宋道軍等[4]研究認為，改良的MS（MS+2.0 mg/L 6-AB+0.1 mg/L NAA）是西瓜愈傷組織誘導的最適培養基；邱敏等[31]將外植體接種于MS+5.0 mg/L 6-BA培養基上誘導愈傷組織，誘導率可達100%；閆靜[32]則發現，使用培養基MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L BA+2.0 mg/L KT誘導京欣愈傷組織時效果最好，不僅誘導率高，而且誘導的愈傷組織質量好，沒有外植體褐化情況發生。

由于西瓜通過誘導愈傷組織形成再生植株難度大、周期長及容易出現玻璃化苗，因此在西瓜再生體系建立中，通常是直接誘導外植體形成不定芽再生完整植株。

1.4.2 激素濃度配比對不定芽誘導的影響

激素是誘導外植體產生不定芽的重要因素之一。不同的激素類型和濃度配比對不定芽影響明顯，很多學者對此也進行了研究。統計結果如表1。

表1的研究結果均為直接誘導外植體產生不定芽，且一定濃度的6-BA是誘導西瓜外植體分化所必須的激素，附加低濃度的IAA、IBA或者NAA則有利于不定芽的誘導分化，但是不同基因型的西瓜不定芽誘導率存在一定的差異。而宋道軍[4]則認為，加入適量的AgNO3能不同程度地提高西瓜外植體不定芽的分化能力，以5 mg/L最為適宜，其對不定芽分化的誘導率最大可以提高10%。有研究指出，在植物離體培養中，AgNO3不僅可減少外植體愈傷組織的形成，使褐化現象受到抑制，而且還能提高芽誘導率[37-39]。

1.4.3 激素濃度配比對不定芽伸長的影響

萬勇等[24]認為，不定芽伸長培養的最佳培養基是MS+0.5 mg/L BA +1.0 mg/L IAA；張志忠等[25]將不定芽移入新鮮的MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA上獲得了很好的伸長效果，這與陳克農等[35]的觀點一致；劉獨臣等[34]利用改良的MS+0.2 mg/L KT+0.01 mg/L IAA培養基對不定芽進行培養，伸長率高達97%；高寧寧等[36]認為，不定芽的最佳伸長培養基為MS+0.2 mg/L KT，任春梅[10]、袁建民[13]及肖守華[14]等也均有類似報道；而李娟[19]則認為，添加了0.2 mg/L KT的MS培養基對不定芽的伸長無明顯促進作用，且伸長后的不定芽較難生根。

1.4.4 激素濃度配比對生根的影響

雖然NAA、KT、IAA和IBA都能明顯地促進生根，但不同激素種類及濃度對生根的影響也有差異。任春梅等[10]認為，KT、NAA和IAA這3種激素對生根誘導無明顯差異；劉獨臣等[34]將不定芽移栽1/2 MS+0.05 mg/L IAA在培養基上生根率達95%；陳克農等[35]則認為，最適宜的生根培養基為1/2 MS+0.4 mg/L IAA；而高寧寧[36]、商麗敏[23]等則認為，最佳的生根培養基為1/2 MS+0.1 mg/L IAA。肖守華等[14]研究認為，在MS培養基中添加0.2 mg/L的IBA或者IAA皆可誘導出形態正常、有明顯根毛的不定根，綜合考慮最終認為，西瓜再生植株生根采用MS+0.2 mg/L IBA培養基較為理想；趙爽[40]則認為，在MS培養基中附加0.05 mg/L NAA最適合再生苗的生根培養。

1.5 培養條件

溫度和光照是影響植物芽誘導的重要環境條件。西瓜外植體離體培養的溫度一般控制在（25±2）℃，最適光照一般控制在1 500～3 000 lx，光照時間控制在12～16 h/d。王春霞等[9]認為，對外植體進行暗處理是獲得高頻再生的關鍵，未經暗處理外植體的出芽率（19%）顯著低于經過6 d暗處理外植體的出芽率（86%）。袁建民[13]的研究認為，先暗培養3 d，待不定根長到0.5 cm左右時轉到光照下培養較為適宜。總之，適當的暗處理有利于不定芽的形成。

2 存在的問題

玻璃化現象在西瓜組織培養過程中比較嚴重。萬勇等[24]研究發現，在不定芽的繼代培養與伸長培養過程中，均有不同程度的玻璃化現象。尤其是芽的伸長，采用MS+KT 0.2 mg/L培養基，有50%的玻璃化苗，這類苗轉入生根誘導后不能形成完整植株。Thomas等[41]也指出，這種情況幾乎無法避免，這與培養基類型、瓊脂濃度、滲透調節物質、通氣情況等均有關。張志忠等[25]通過每2周繼代1次、降低外植體密度和定期于無菌條件下通氣等措施，在很大程度上緩解了玻璃化現象，芽伸長過程中繼代時適當降低激素濃度也有所幫助。

此外，許多研究表明，西瓜試管苗的生根都比較容易，但直接移栽有難度，需通過嫁接保證其成活率[2-3，10]。孫治圖等[18]將試管苗先移入消毒的草炭和蛭石，待其長出新根后再移栽，采用這種延緩試管苗移栽的方法，可以讓試管苗在無菌條件下適應移栽后的生長環境，提高其適應能力，減少根系的損傷，起到煉苗作用，提高其成活率。

3 展望

目前，有報道通過誘導完全脫分化愈傷組織，然后進行再生不定芽培養，已經成功獲得了由伊選和京欣兩類西瓜間接再生不定芽，并通過伸長、生根培養獲得了完整植株。但是愈傷組織再生成不定芽的頻率很低，因此，需要進一步加強這方面的基礎理論研究。另外，如何采取更加有效的措施解決西瓜組織培養過程中的問題也必不可少，這將為建立適合西瓜的快速、高效繁殖再生體系提供有力保障。

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