高效液相色譜法測定高?；Y冷膠中乙酰基和甘油酰基含量

曹　琳，朱　莉，詹曉北，*，鄭志永，吳劍榮

（1.江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫 214125）

高效液相色譜法測定高酰基結冷膠中乙酰基和甘油酰基含量

曹琳1，朱莉2，詹曉北1，*，鄭志永1，吳劍榮1

（1.江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫 214125）

建立高效液相色譜分別測定結冷膠中乙酰基和甘油酰基含量的方法。通過水解方法將?；鶑慕Y冷膠分子中游離出來，酸化為乙酸和甘油酸（或酸根離子），醇沉將結冷膠除去，高效液相色譜檢測有機酸的含量，再根據有機酸與相應酰基的分子質量關系，用內標法，并以丙酸作為內標物，計算得到2 種?；暮?。使用HPX-87H色譜柱，以5 mmol/L硫酸溶液作為流動相，在柱溫35 ℃，流速0.6 mL/min條件下，利用紫外檢測器進行檢測，檢測波長210 nm。結果表明，此方法可同時定量2 種目的物，20 min內可完成測定，且靈敏度高，重復性和穩定性良好。實驗測得本實驗室生產的結冷膠中甘油酰基和乙?；馁|量分數分別為9.94%、3.29%，甘油?；訕嘶厥章蕿?7.76%，相對標準偏差為0.59%，乙?；訕嘶厥章蕿?3.49%，相對標準偏差為1.29%。

高效液相色譜法；結冷膠；乙?；桓视王；?/p>

結冷膠是由伊樂藻假單胞菌（Pseudomonas elodea ATCC 31461）有氧發酵合成的微生物胞外多糖［1］，其用途非常廣泛，與其他同類產品相比具有用量少、透明度高、香氣釋放能力強，耐酸耐熱能力強等優點［2］，可作為乳化劑、懸浮劑、膠凝劑、成膜劑、潤滑劑等應用于食品、石油、化工、制藥中［3］。結冷膠還具有良好的復配性，可與瓊脂［4］、明膠［5］及葡聚糖［6］等多糖復配，獲得性質更為優良的復配膠，使其應用更為廣泛。它的基本結構是由葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸以2∶1∶1的物質的量比組成的線性四糖重復單位，分子質量為0.5×106D［7］，具體結構如下［8］：

→ 3）-β-D-Glcp-（1 → 4）-β-D-GlcpA-（1 →4 ）-β-D-Glcp-（1 → 4）-α-L-Rhap-（1 →

商品形式的結冷膠主要有2 種，高?；Y冷膠和低?；Y冷膠［9］，目前主要集中于低?；Y冷膠的特性及應用研究［10］。高?；Y冷膠在同一葡萄糖殘基的O-2和O-6位置處分別連接有甘油酰基和乙?；?，每個重復單元約有1 個甘油?；?.5 個乙?；?1］。低?；Y冷膠是由天然結冷膠在熱堿溶液中脫酰基后得到的［12］，酰基含量不同，結冷膠形成的凝膠性質也不同，高?；Y冷膠凝膠柔軟、彈性、黏著力強；而低?；Y冷膠形成的凝膠強度大，易脆裂［13］。

很多文獻對結冷膠的凝膠機制、2 種?；鶎Y冷膠性質的影響進行了研究。Noda等［14］闡述了溶液中結冷膠的凝膠機制，首先，在加熱條件下，結冷膠在溶液中呈無序卷曲狀態，隨著液體冷卻，結冷膠分子逐漸轉變為有序的雙螺旋結構，并形成氫鍵及范德華力等穩定雙螺旋結構的作用力。Chandrasekaran等［15］研究了天然結冷膠上2 種酰基對雙螺旋結構及結冷膠性質的影響，認為甘油?；挥陔p螺旋結構內部，它改變了雙螺旋的幾何構型并增加雙螺旋鏈內氫鍵的個數，增加了結冷膠凝膠的黏度；而乙酰基位于雙螺旋結構外側，在一定程度上阻礙雙螺旋間的聚集，降低凝膠雙螺旋結構的穩定性。陽離子也是影響結冷膠性質的重要因素，Huicochea等［16］研究了離子對結冷膠凝膠溫度的影響，發現加入離子會造成結冷膠凝膠溫度升高，形成更為穩定有序的凝膠結構，且二價陽離子較一價陽離子更為有效。同時，Morris等［17］認為，甘油?；拇嬖跁璧K陽離子與結冷膠的連接，因此，離子對高酰基結冷膠的促凝膠作用相對較弱。

多糖中?；康臏y定有很多方法，Mccomb等［18］曾用比色法，利用乙酰羥肟酸和Fe3+的顯色反應測定了果膠中O-乙?；暮?，Cheethamm等［19］曾用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法，分別測定了黃原膠中丙酮?；蚈-乙酰基的含量，Kao等［20］曾用高效陰離子交換色譜配電導率檢測方法分別測定了微生物胞外多糖中O-乙?；蚇-乙?；暮?。對于結冷膠上O-甘油酰基的測定研究較少，Kuo等［21］曾將結冷膠上的甘油?；苌笥脷庀嗌V測定了其含量，秦方等［22］曾利用酸堿滴定的方法測定了結冷膠的總?；?。不同廠家、批次生產的結冷膠及不同的測定方法得到的酰基含量也不盡相同。Morris等［11］曾在其綜述中報道結冷膠中的?；?，甘油?；考s10%～12%，乙?；考s4%，按每個四糖單元?；鶄€數計算，甘油酰基約0.72～0.87 個，乙酰基約0.52 個；Jay等［23］曾報道由其實驗室培養的野生型菌株生產的結冷膠，每個四糖重復單元有甘油?；s0.49 個，乙?；s0.6 個，Mazen等［24］報道由其實驗室生產純化后的天然結冷膠，每個四糖重復單元有甘油?；s為0.8 個，乙酰基約0.8 個。若能準確測得2 種酰基的含量，不僅可以更好地研究2 種?；謩e對結冷膠性質的影響，2 種酰基的總含量及比例也是監測高?；Y冷膠產品品質的重要指標之一。而?；糠謩e測定的具體方法一直少有報道，因此急需建立一種靈敏度高，準確性及重復性良好的測定方法。本實驗在前人研究的基礎上，用內標法定量，以丙酸作為定量內標物，考察能夠分別測定甘油?；鸵阴；康腍PLC方法，以期為結冷膠的深入研究提供一定的實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

結冷膠 江南大學生化工程與生物反應器實驗室［25］；一水合甘油酸半鈣鹽（色譜純） 美國Sigma公司；乙酸（色譜純） 上海沃凱化學試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、丙酸、硫酸（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；實驗中所用的水均為超純水。

1.2儀器與設備

LC-2010A高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器及LabSolutions色譜工作站） 日本島津公司；88-1大功率磁力攪拌器 常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1結冷膠樣品水分和灰分含量的測定

結冷膠樣品中水分含量測定按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中直接干燥方法進行［26］；灰分含量測定按照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》中馬弗爐灼燒的方法進行［27］，分別進行3 次平行實驗。按下式計算：

式中：X1為結冷膠中水分或灰分的含量；m1為烘干前稱量瓶和結冷膠的總質量或灼燒后坩堝和剩余灰分總質量/g；m2為烘干后稱量瓶和結冷膠的總質量或坩堝質量/g；m0為初始稱量的結冷膠樣品質量/g。

1.3.2混合標準溶液的配制

以乙酸和甘油酸作為標準物，以丙酸作為定量內標物。精確量取3 種物質適量，用水定容，配制成質量濃度0.75 g/L甘油酸標準溶液，質量濃度0.45 g/L乙酸標準溶液，質量濃度1.05 g/L丙酸標準溶液。將3 種標準溶液等體積混合，制成混合標準溶液。再配制質量濃度0.70 mg/L的丙酸溶液以備后用。將配制好的標準溶液置于4 ℃冰箱中保存。進行HPLC檢測前，過0.22 μm濾膜。

1.3.3 結冷膠樣品預處理

取適量的結冷膠樣品，加入去離子水100 mL在80 ℃條件下充分攪拌溶解，配制成質量濃度為0.50 g/100 mL的均勻溶膠。取1 mL該溶膠于50 mL離心管中，加入1 mL 0.20 mol/L NaOH溶液，混勻后放于80 ℃水浴搖床中水解30 min，搖床轉速150 r/min，將乙?；透视王；鶑慕Y冷膠上完全脫落下來。

取出上述溶液，冷卻至40～50 ℃時，加入6 mL乙醇，劇烈振蕩混勻，放置4 ℃醇沉1～1.5 h，將離心管置于離心機中8 000 r/min，離心30 min后，結冷膠形成貼壁緊實的沉淀，取上清液6 mL轉移至另一10 mL離心管，將結冷膠大分子和游離酰基溶液分開。將離心管置于真空干燥箱內，70 ℃干燥至白色固體，加入0.30 mol/L鹽酸調節pH值至酸性，混勻并用水定容至1 mL，同時加入質量濃度0.70 g/L丙酸標準溶液1 mL作為定量內標物。過0.22 μm的微濾膜，進樣，每個樣品重復進樣3 次。

1.3.4HPLC檢測條件

液相條件1：Aminex HPX-87H色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相：5 mmol/L硫酸等度洗脫；流速0.6 mL/min；紫外檢測器檢測，波長210 nm；進樣量20 μL。

液相條件2：Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相體積比為甲醇（A）∶0.05%磷酸溶液（B）=3∶97，等度洗脫；流速0.8 mL/min；紫外檢測器檢測，波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3.5比色法和滴定法測定?；?/p>

實驗中利用秦方等［22］報道的滴定法、陳玲［28］和羅秉俊［29］等所報道的比色法測定結冷膠樣品中的?；浚⒔Y果與本實驗所述的HPLC方法測定結果進行比較。

2　結果與分析

2.1結冷膠樣品水分和灰分含量測定

發酵提取后的結冷膠樣品中仍然含有水分和少量無機離子等灰分，要對結冷膠樣品進行成分分析，了解其中多糖的實際含量，才能準確得到?；诮Y冷膠中所占質量分數。

通過干燥法和灼燒法分析結果可知，在結冷膠樣品中，水分含量為9.53%，灰分含量為5.26%，樣品中多糖的實際含量為85.22%。

2.2色譜條件的選擇

乙酰基和甘油酰基與結冷膠主鏈上的羥基連接，形成酯鍵。在樣品預處理過程中，通過NaOH溶液水解將乙?；透视王；坞x下來，成為R—COONa羧酸鹽形式，加入鹽酸將其酸化為有機酸（即乙酸和甘油酸），再進行HPLC檢測，即可得到2 種有機酸的質量濃度。2 種?；暮靠筛鶕袡C酸與相應?；姆肿淤|量關系計算得到。

HPLC檢測條件的選擇，主要從測定波長、色譜柱以及內標物質等方面進行考察。選擇合適的色譜柱和色譜條件，才能將2 種物質目的峰有效分開，同時選擇合適的內標物質，才能對目的物準確定量。

2.2.1測定波長的選擇

根據有機酸羧基的紫外光吸收特性，對目的物溶液在波長200～300 nm處進行全波長掃描，發現在波長210 nm處，3 種目的物均有較強吸收峰，因此選取210 nm作為檢測波長。

2.2.2色譜柱的選擇

圖1　不同色譜柱分析甘油酸和乙酸標準溶液色譜圖Fig.1　Chromatogram of glyceric acid and acetic acid standards separated by different columns

實驗中選用迪馬Diamonsil C18（2）和Bio Rad Aminex HPX-87H 2 種色譜柱，觀察2 種目的物在2 個色譜柱上的分離效果。選用C18色譜柱可以將標準品中2 種目的物分開，10 min內即可全部檢測，如圖1A所示，但甘油酸出峰時間過早（3.912 min），在樣品測定中受到溶劑峰和雜峰的嚴重干擾，乙酸目的峰也受到雜峰干擾，不能準確定量。且流動相中甲醇含量過低，僅為體積分數3%，若增加甲醇的含量，甘油酸出峰更早，對檢測無益；降低甲醇含量，有機相含量過低會影響色譜柱的使用壽命。改變流速和柱溫，目的峰受到雜峰干擾的情況沒有改善。

HPX-87H色譜柱通過離子調節分配層析技術，根據待分析樣品的多種化學特性分離混合物。實驗中用稀硫酸作流動相，可以將標準溶液中2 種有機酸有效分開，如圖1B所示，甘油酸出峰時間10.803 min，乙酸出峰時間15.183 min，20 min內即可將2 種物質全部洗脫下來，可以看到2 個目的峰分離度較好，且在樣品色譜圖中不受雜峰干擾，可以準確定量。因此本實驗中優先選用Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱。

2.2.3內標物質的選擇

定量內標物應是原樣品中不存在的物質，性質與待測組分相近，不參與反應，必須與樣品中目的物出峰時間不重合。實驗中選取檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸和丙酸進行HPLC檢測，幾種酸出峰時間分別為8.106、9.891、8.657、12.621 min和18.007 min，由于樣品經過堿水解反應處理，雜峰較多，檸檬酸、酒石酸和乳酸出峰處都受雜峰干擾；普通蘋果酸存在同分異構體，出現2 個峰，無法定量；而丙酸出峰處無雜峰干擾，出峰時間與乙酸接近且不重疊，可以準確定量，因此，選用丙酸作為內標物質。

2.3方法考察實驗

確定色譜檢測條件后，通過對該方法檢出限和定量限、線性關系及范圍、重復性、穩定性和加標回收率等參數的測定，驗證HPLC方法的可行性。

2.3.1檢出限、定量限及線性關系考察

將配制好的標準品溶液逐級稀釋，得到一系列甘油酸和乙酸標準品溶液，按1.3.4節的HPLC方法進行檢測分析。然后以目的峰峰面積為縱坐標（y），以標準品物質質量濃度為橫坐標（x）作圖，得到線性方程和相關系數如表1所示，甘油酰基在12.80～358.64 mg/L范圍內線性關系良好，乙酰基在7.33～220.04 mg/L范圍內線性關系良好。

將標準溶液進一步稀釋并檢測，以信噪比為3時的標準品質量濃度作為檢出限，以信噪比約為10時的標準品質量濃度作為定量限，確定檢出限和定量限，結果如表1所示。

表1　甘油酰基和乙?；貧w分析、檢出限和定量限Table1　Regression analysis， limits of detection and limits of quantitation for glyceroyl and acetyll

2.3.2重復性實驗

按照1.3.3節中樣品處理方法，平行制備6 份結冷膠溶膠樣品，按照1.3.4節中的HPLC方法進行檢測，記錄峰面積，并按照峰面積計算目的物含量。結果測得甘油?；|量濃度為（159.16±2.52）mg/L，平行實驗的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.10%，乙?；|量濃度為（53.22±3.61）mg/L，平行實驗的RSD為4.04%，精密度良好。

2.3.3穩定性實驗

取預處理后的樣品溶液，按1.3.4節中的HPLC方法，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進樣，按照峰面積計算目的物含量，并計算其RSD。表2結果顯示，甘油?；|量濃度的RSD為0.12%，乙?；|量濃度的RSD為0.21%，可見試品溶液在24 h內穩定。

表2　甘油?；鸵阴；€定性實驗Table2　Stability for glyceroyl and acetyl

2.3.4加標回收率實驗

配制0.50 g/100 mL的結冷膠溶膠，取1 mL樣品共7 份，其中1 份作為對照溶液，直接按照1.3.3節中的方法進行處理，其余6 份在處理前，每份中加入質量濃度59.34 g/L甘油酸標準品10 μL，以及15.02 g/L乙酸標準品10 μL，然后按照1.3.3節中的方法進行樣品前處理，進樣檢測，并按照峰面積計算目的物含量。

表3　甘油?；鸵阴；訕嘶厥章蔜able3　Recoveries for glyceroyl and acetyl

測定結果如表3所示，其中甘油酰基的加標回收率平均值為97.76%，精密度RSD為0.59%，乙?；募訕嘶厥章势骄禐?3.49%，精密度RSD為1.29%，可知方法準確性良好。

2.4結冷膠產品?；繙y定

圖2　混合標準溶液和結冷膠樣品色譜圖Fig.2　Chromatograms of mixed standards and gellan gum sample

按照1.3.3節對結冷膠樣品進行處理，并進行HPLC檢測。混合標準溶液和結冷膠樣品色譜圖如圖2所示。?；繙y定結果如表4所示。

表4　結冷膠樣品?；繙y定Table 4　Determination of acyl contents in gellan gum sample

由表4可知，本實驗室生產的結冷膠甘油酰基和乙酰基質量分數分別為9.94%、3.29%，總?；|量分數為13.24%。在結冷膠每個四糖重復單元中所占個數為甘油酰基0.83、乙?；?.57。由圖2B可以看到，甘油酸和乙酸目的峰分離較好，雖然樣品色譜圖中雜峰較多，但沒有影響目的峰，丙酸出峰時間18.007 min，峰形良好，與目的峰有較好的分離度，且不受雜峰干擾，因此HPLC方法可以準確定量，且能夠分別測定2 種?；馁|量濃度。

2.5HPLC方法與其他測定方法的比較

實驗中利用滴定法和比色法測定相同結冷膠樣品的酰基含量，這2 種方法只能測定總?；浚味ǚy得結冷膠總?；|量分數為（13.96±2.21）%，比色法測得結冷膠總酰基質量分數為（14.59±0.78）%。HPLC法測定結果如表4所示，2 種方法的測定結果與HPLC方法相比皆偏大。

滴定法原理為堿性條件下發生酯化反應逆反應并消耗堿［11］，再用酸滴定得到消耗的堿的量，滴定時利用酚酞做指示劑，實驗操作簡便，使用試劑和儀器簡單，但缺點在于高?；Y冷膠在60 ℃以下則形成凝膠，如果在室溫條件下用酸滴定，酸不能均勻分布于溶膠中，造成滴定終點時需要酸的體積偏大，測定結果偏大；如果在加熱狀態下滴定，會影響酚酞和堿的顯色平衡反應向生成酚酞二鈉鹽（紅色）方向移動，因此到達滴定終點所需酸體積偏大，滴定結果也偏大，且由數據可以看出結果波動性較大，重復性差。在HPLC方法和比色法的樣品前處理過程中，將結冷膠與游離酰基溶液有效分開，且不產生影響測定的副產物，是準確測定?；康年P鍵步驟。在HPLC方法檢測中，如果結冷膠凝膠進入色譜柱就很難將其沖洗出來，凝膠的存在會堵塞色譜柱并滋生細菌，對色譜柱造成永久性損害；在比色法中利用羥肟酸和Fe3+的顯色反應測定酰基含量［18］，顯色反應需在室溫條件下進行，同時加入Fe3+，進一步促進了結冷膠凝膠的形成，測定吸光度時發生丁達爾效應，造成測定結果偏大。且凝膠雙螺旋結構中可能包埋一定量的?；粼陲@色物形成后離心除去結冷膠，會損失大量顯色復合物，造成結果偏小。若按本實驗所述樣品前處理方法，得到游離?；芤涸龠M行比色測定，由于樣品需經過堿水解處理，產生其他副產物，且加入的堿溶液改變了顯色溶液的pH值，也會造成比色結果不可信。同時，滴定法和比色法都只能測定總?；?，而HPLC方法可以同時測定2 種酰基各 自的含量，這對于深入研究2 種?；髯詫Y冷膠性質的影響具有重要意義。

3　結 論

本研究建立了檢測結冷膠中2 種?；康腍PLC方法。由于2 種酰基（O-甘油酰基和O-乙?；┑男再|較為相近，常用的滴定法和比色法都只能測定總酰基含量，且準確性和可行性還有待考證。本實驗考察的HPLC法能分別測定結冷膠上2 種酰基的含量，預處理過程中將膠體和待測物質分開，有效避免了大分子物質對色譜柱的不良影響，內標法定量降低誤差，結果更為準確，方法靈敏度高，穩定性和重復性良好，分析效率高。?；繙y定，是初步分析結冷膠結構和性質的基礎，可促進研究不同?；繉Y冷膠性質產生差異的分子結構原因。同時，?；渴歉啧；Y冷膠產品品質的重要評價指標，本方法可準確分析高?；Y冷膠產品中不同酰基組成差異，有利于建立更高標準的產品檢測方法和生產規范，同時有利于開發具有精確結構特征的結冷膠生產工藝。

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Determination of Glyceoyl and Acetyl in High Acyl Gellan Gum by HPLC

CAO Lin1， ZHU Li2， ZHAN Xiaobei1，*， ZHENG Zhiyong1， WU Jianrong1
（1. Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology，Jiangnan University， Wuxi 214122， China； 2. Jiangsu Rayguang Biotechnology Co. Ltd.， Wuxi 214125， China）

A method to measure the contents of glyceoyl and acetyl in gellan with high performance liquid chromatography（HPLC） was established. Acyl groups were dissociated from gellan by hydrolization and acidized to obtain acetic acid and glyceric acid. Then alcohol precipitation was used to remove the gel and the contents of the two kinds of organic acids were assayed by HPLC. The contents of the two acyl groups were calculated according to the corresponding relationship in molecular weight between the acyl groups and organic acids， using propionic acid as the internal standard substance. The chromatographic column used was HPX-87H with 5 mmol/L sufuric acid as the mobile phase at a fl ow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was maintained at 35 ℃， and the analytes were detected at a UV wavelength of 210 nm. The method could quantify these two organic acids simultaneously within 20 min. It is an efficient method with excellent repeatability and stability. The contents of glyceroyl and acetyl of gellan produced in our laboratory were 9.94% and 3.29% with spiked recoveries of 97.76% and 93.49%， respectively.

high performance liquid chromatography （HPLC）； gellan； acetyl； glyceroyl

TS227；O657.72

A

1002-6630（2015）14-0059-06

10.7506/spkx1002-6630-201514012

2014-11-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD23B04）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2012AA021505）；國家自然科學基金面上項目（31171640）；無錫市科技支撐計劃項目（CLE01N1208）；無錫市中小企業創新基金項目（CBE01G1344）

曹琳（1989—），女，碩士研究生，研究方向為糖生物制造。E-mail：caolin15@163.com

詹曉北（1962—），男，教授，博士，研究方向為工業發酵與生物化工、糖生物技術。E-mail：xbzhan@yahoo.com