大豆浸泡過程中腐敗微生物對豆漿品質的影響

劉麗莎，彭義交，鮑魯生，田　旭，呂曉蓮，白　潔，李玉美，郭　宏，*

（1.北京食品科學研究院北京市食品研究所，北京 100162；2.北京二商集團有限責任公司，北京 100053）

大豆浸泡過程中腐敗微生物對豆漿品質的影響

劉麗莎1，彭義交1，鮑魯生1，田旭1，呂曉蓮2，白潔1，李玉美1，郭宏1，*

（1.北京食品科學研究院北京市食品研究所，北京 100162；2.北京二商集團有限責任公司，北京 100053）

通過對大豆浸泡過程中腐敗微生物種類及數量開展研究，經致腐細菌回接實驗進一步探明豆漿腐敗現象與致腐細菌的關系，為豆漿穩定性控制及豆制品加工自動化提供依據。從大豆浸泡水中分離3 株優勢菌DF-1、DF-2和DF-3，結合形態學及16S rDNA序列分析，分別鑒定為短穩桿菌、產氣腸桿菌和乳酸乳球菌。將優勢菌分別回接至滅菌豆漿，于25 ℃保藏12 h，理化指標結果表明3 種微生物對豆漿品質影響有較大差異：短穩桿菌產黃色素，在豆漿表面形成黃色菌膜并產生腐臭味；產氣腸桿菌產酸產氣，使豆漿形成蜂窩狀凝乳，腐敗變餿；乳酸乳球菌產酸使豆漿凝固。本研究為豆制品自動化生產過程中控制豆漿品質及加工穩定性提供參考。

豆漿；浸泡工藝；腐敗微生物

北豆腐作為植物蛋白的主要來源，富含蛋白質、微量元素和不飽和脂肪酸，深受消費者喜愛，是我國消費量較大的日常食品［1-2］。同時由于大豆營養豐富，生產過程中容易被微生物污染［3］，尤其是在煮漿之前，微生物污染極其嚴重［4］。目前國內北豆腐生產企業大都采用半自動化設備沿用傳統加工工藝，大豆磨漿之前需浸泡8～12 h，微生物增殖迅速，企業在加工過程中需換水避免微生物過量繁殖，不僅耗費大量水資源，還給環境造成嚴重污染。此外，由于泡豆工序耗時長，企業一般在上午磨漿制備全天所用豆漿，生豆漿放置到下午時易出現發黏、發臭、pH值下降、表面黃膜等腐敗現象，嚴重影響豆漿穩定性及豆腐品質，給消費者帶來潛在的安全問題；嚴重腐敗時，只能作為廢液排放，給企業帶來經濟損失，也會對環境造成一定的影響。

目前已有較多針對豆腐腐敗微生物的研究，關于豆漿制備及放置過程中的微生物腐敗作用還沒有人報道。本研究針對豆制品加工過程中腐敗微生物種類及增殖趨勢開展研究，分析腐敗菌對豆漿的腐敗作用，為開發新型大豆浸泡工藝，控制豆漿品質及穩定性提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大豆：無蟲蝕、無霉變大豆，取自北京二商希杰食品有限責任公司。

溶菌酶、蛋白酶K、細菌總DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 寶生物技術有限公司；引物合成及序列測定由北京博邁德生物技術有限公司完成；其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國TechNet公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司；NDJ-1旋轉黏度計 上海尼潤設備有限公司。

1.3方法

1.3.1致腐細菌分離及檢測

大豆采用傳統浸泡工藝，即用3 倍體積自來水漂洗1 次，用3 倍自來水浸泡大豆，室溫條件下（約25 ℃）浸泡12 h，每隔3 h取樣檢測菌落總數［5］。將長出的菌落按菌落形態和鏡檢結果進行分離純化。

1.3.2菌株初步鑒定

采用細菌總DNA試劑盒提取腐敗菌DNA，16S rRNA鑒定引物：LPW57（5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、LPW205（5’-CTTGTTACGACTTCACCC-3’）［6］；PCR反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 11.50 μL，上、下游引物各1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10 μL；反應程序：94 ℃初始變性5 min，94 ℃變性1 min，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環，72 ℃終延伸10 min［7］。PCR反應產物純化后，連接T載體后測序（北京博邁德生物技術有限公司），將結果與GenBank中收錄的其他菌株序列進行分析比對，初步確定大豆浸泡過程的腐敗微生物種類。

1.3.3腐敗菌對豆漿的微生物效應研究

新鮮豆漿經115 ℃、20 min殺菌后，按2%接種DF-1、DF-2、DF-3，于25 ℃培養，每3 h取樣檢測，研究腐敗菌對豆漿的微生物效應。

1.3.3.1感官評價

挑選豆制品加工經驗豐富的人員對豆漿色澤、氣味及質地進行評價，衡量豆漿的品質及腐壞程度。

1.3.3.2活菌數測定

無菌吸取豆漿樣品按10 倍梯度稀釋至合適梯度，用稀釋平板法測定各組細菌數。

1.3.3.3pH值測定

采用pH計在25 ℃條件下測定豆漿樣品的pH值。

1.3.3.4黏度測定

采用NDF-1旋轉式黏度計，在25 ℃測定酸乳樣品的黏度。測定條件：27#轉子，80 r/min，30 s取值。

2　結果與分析

2.1腐敗菌在大豆浸泡過程中的生長規律研究

圖1　浸泡過程微生物生長曲線Fig.1　Growth curves of spoilage bacteria during soybean soaking

圖1顯示，在大豆浸泡過程中，微生物呈直線上升趨勢，經25 ℃浸泡12 h，活菌數從105CFU/mL增長到108CFU/mL，其中DF-3（乳酸乳球菌）的初始菌落數及增殖速度最快，浸泡結束可達108CFU/mL，DF-1和DF-2活菌數分別增至107CFU/mL和106CFU/mL，泡豆水變渾濁，產生大量氣泡。在工業化制漿過程中，為降低微生物污染采用流水浸泡方式，浪費大量水資源，且給企業帶來巨大的治污負擔，流水浸泡過程還會帶走部分大豆的營養成分，對豆腐出品率造成影響。

2.2腐敗菌的分離純化

挑取單菌落劃線分離純化，并觀察菌落形態，革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察菌體形態。

圖2　腐敗菌菌落形態圖Fig.2　Colonial morphology of three spoilage bacteria from soaked soybeans

如圖2所示，大豆在浸泡過程中主要有3 種不同形態的菌落存在，其菌體形態如圖3所示。DF-1在營養瓊脂上為典型的黃色菌落，邊緣整齊，光滑有光澤，顯微鏡下為革蘭氏陰性球桿菌。DF-2為較大乳白色圓形菌落，邊緣不規則，革蘭氏染色呈陰性。DF-3為白色針尖狀小菌落，顯微鏡下為革蘭氏陽性鏈球菌。DF-1、DF-2的菌落形態與韓磊等并所述豆漿中菌落形態相似［8-9］，但對于腐敗菌的種類及對豆漿的腐敗作用并未涉及。

圖3　腐敗菌細胞形態圖Fig.3　Morphology of three spoilage bacteria from soaked soybeans

2.316S rDNA序列同源性分析

提取菌株的總DNA為模板，以引物LPW57、LPW205進行PCR擴增，得到約1 500 bp的目的片段，測序結果顯示DF-1、DF-2、DF-3的16S rDNA片段長度分別為1 384、1 420、1 420 bp（結果未列出），經NCBI中BLAST進行序列同源性比對，菌株DF-1與Empedobacter brevis LMG 4011（Genbank序列號：NR_042471.2）同源性為100%，菌株DF-2與Enterobacter aerogenes EA1509E（Genbank序列號：FO203355.1）同源性為99%，DF-3與Lactococcus lactis PON10072（GenBank序列號：KC417004.1）同源性為99%。結合菌株形態學，將3 株腐敗菌初步鑒定為短穩桿菌（舊稱短黃桿菌Empedobacter brevis）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）及乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。本實驗中豆漿腐敗微生物豆腐等豆制品中微生物種類有較大差別，主要與豆制品加工過程需高溫煮漿有關。非發酵類豆制品主要為耐熱芽孢桿菌［10-11］及后期污染的腸道菌［12-13］，此外還存在假單胞菌［14-15］、乳酸菌［16］和吉氏庫特氏菌［17］等腐敗微生物，研究人員已開展豆腐腐敗微生物控制研究［18-19］，但影響豆制品加工過程中豆漿品質及穩定性的微生物種類還未有報道，其微生物種類及數量主要與大豆原料中攜帶的微生物有關。

2.4腐敗菌對豆漿品質的影響研究

2.4.1感官評價

接種后的豆漿感官變化如表1所示，25 ℃放置12 h后樣品如圖4所示。

表1　感官評價結果Table1　Sensory evaluation of inoculated soymilk during storage at 25 ℃

圖4　微生物對豆漿感官品質的影響Fig.4　Effects of three spoilage bacteria on appearance of soymilk

豆漿滅菌后為乳白色，流體狀，豆香味濃郁，放置12 h內無明顯感官變化，pH值、色澤、黏度、氣味及微生物均無明顯變化。DF-1放置9 h，表面開始長黃膜，并有輕微的臭味，由于短穩桿菌為嚴格好氧菌［20］，且能產生黃色素，表面黃膜可能是DF-1形成的菌膜。DF-2為產氣菌，從6 h后開始產生大量氣泡，呈鼻涕狀半流體，放置12 h呈蜂窩狀凝乳，有濃郁的腐臭味，可能與其產生大量生物胺有關。接種乳酸乳球菌的樣品放置12 h產生類似酸乳的凝乳塊，無明顯的腐臭味，有較濃郁的發酵酸味。

2.4.2活菌數變化

圖5　腐敗菌在豆漿中的生長曲線Fig.5　Growth curve of three spoilage bacteria in soymilk

豆漿中微生物活菌數變化趨勢如圖5所示，3 株腐敗菌在豆漿中的生長速度及對豆漿的微生物效應均有差異。3株腐敗菌以2%（105CFU/mL）接種后，在前3 h處于遲緩期，活菌數均保持穩定，3 h后開始進入對數生長期，由于樣品溫度為25 ℃，比適宜生長溫度下增長速率緩慢。培養9 h，DF-2和DF-3活菌數分別為7.5×106CFU/mL和8.9×106CFU/mL，對樣品的pH值、感官有較明顯的影響。DF-1活菌數增長速度較慢，放置12 h后活菌數為9.8×105CFU/mL。由于DF-1為嚴格好氧菌，DF-2及DF-3為兼性厭氧菌，故DF-1在靜置豆漿中生長速度較慢。

2.4.3腐敗菌對豆漿理化性質的影響

接種3 株腐敗菌后，定期測定豆漿的pH值及黏度變化，結果如圖6和7所示。

圖6　腐敗菌對豆漿pH值的影響Fig.6　Effects of three spoilage bacteria on pH value of soymilk

圖7　腐敗菌對豆漿黏度的影響Fig.7　Effects of three spoilage bacteria on viscosity of soymilk

從圖6、7可看出，DF-2、DF-3對豆漿的pH值及黏度影響較大，均在9 h出現顯著的變化，pH值下降，黏度上升。微生物生長使脂肪分解成脂肪酸或碳水化合物分解成有機酸，使豆漿pH值下降，引起豆漿蛋白凝聚，形成凝乳或變稠。研究表明產氣腸桿菌及乳酸乳球菌均可發酵碳水化合物產生乳酸［21］，DF-2、DF-3黏度升高可能由酸凝乳所致。DF-1（穩桿菌屬）屬于非發酵型微生物，豆漿的pH值及黏度并無明顯變化。這3 類菌對高溫耐受性普遍較低，基本可在煮漿過程中殺滅（95 ℃、5～10 min）［22］，在成品豆腐中檢出率較低，但由于生豆漿加熱前無其余殺菌措施，在溫度適宜條件下，腐敗菌大量繁殖，導致豆漿腐敗變質，從而使豆腐等豆制品的出品率下降或品質劣變。

3　結 論

豆漿品質不穩定是目前國內豆制品企業實現全自動化生產的行業瓶頸。由于泡豆及制漿設備為敞開式，原料及環境中微生物污染嚴重，加工過程微生物生長繁殖迅速，導致豆漿的理化性質不穩定，難以在點腦過程實現自動化控制，影響豆腐等豆制品生產效率及品質。本實驗針對大豆浸泡過程中主要腐敗微生物開展研究，確定引起豆漿腐敗的主要微生物為短穩桿菌、產氣腸桿菌及乳酸乳球菌，并分析了豆漿品質劣變的主要原因，短穩桿菌產生色素引起豆漿表面發黃，產生腐臭味；產氣腸桿菌產酸產氣，導致豆漿黏度增大，形成蜂窩狀凝乳，有腐臭味；乳酸乳球菌產酸導致豆漿凝乳，對豆漿的氣味無太大影響。短穩桿菌是一類條件致病菌可引發敗血癥［23-24］，目前研究主要應用于植物病蟲害生物防治；產氣腸桿菌是食品中常見的腐敗菌，代謝形成尸胺、腐胺等生物胺產生嚴重腐臭味［25］，帶來潛在的質量及安全問題。由于這兩類菌較少出現在成品豆腐中，未引起研究人員的重視，在豆制品相關研究中的報道較少，對于其安全性、致病性研究較少。后續需針對豆制品加工中腐敗微生物的安全性及控制開展研究，提高豆漿穩定性，實現豆制品加工自動化生產，確保豆制品質量與安全。

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Growth of Spoilage Microorganisms during Soaking of Soybean and Their Effects on Soymilk Quality

LIU Lisha1， PENG Yijiao1， BAO Lusheng1， TIAN Xu1， L? Xiaolian2， BAI Jie1， LI Yumei1， GUO Hong1，*
（1. Beijing Food Research Institute， Beijing Academy of Food Sciences， Beijing 100162， China；2. Beijing Er Shang Group Co. Ltd.， Beijing 100053， China）

In this research， three spoilage microorganisms named DF-1， DF-2 and DF-3， respectively were separated from soaked soybeans. Based on their morphological and physiological characteristics， and 16S rDNA analysis， these three strains were identifi ed as Empedobacter brevis， Enterobacter aerogenes and Lactococcus lactis， respectively. To investigate their effects on soymilk quality， sterile soymilk was inoculated with each of these spoilage strains and stored at 25 ℃ and changes in physicochemical indicators were measured during 12 h of storage. Physicochemical properties of soymilk were affected signifi cantly differently by the three spoilage bacteria. When being cultivated in soymilk， DF-1 produced yellow fi lms with putrefactive odor on the surface of soymilk while DF-2 produced gas and acid and formed a honeycomb-like gel indicating spoilage of soymilk. DF-3 also produced acid and caused coagulation of soymilk like yogurt. This research can lay a foundation for quality and processing stability control of soymilk during automatic production of soybean products.

soymilk； soaking process； spoilage microorganisms

TS214.2

A

1002-6630（2015）14-0161-04

10.7506/spkx1002-6630-201514031

2014-10-28

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102105）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B03-2）

劉麗莎（1989—），女，工程師，碩士，研究方向為食品微生物及代謝產物。E-mail：liulisha0616@sina.com

郭宏（1961—），男，高級工程師，碩士，研究方向為豆制品加工及綜合利用。E-mail：guohong1961@sina.com