固相萃取-氣相色譜-質譜聯用法篩查食用菌中的農藥殘留

胡秋輝，張昌娟，鄭惠華，邱偉芬，楊文建，趙立艷

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通 226010；3.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

固相萃取-氣相色譜-質譜聯用法篩查食用菌中的農藥殘留

胡秋輝1，張昌娟1，鄭惠華2，邱偉芬1，楊文建1，趙立艷3

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通 226010；3.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

采用氣相色譜-質譜聯用結合NAGINATA?軟件建立了篩查食用菌中多 種農藥殘留的分析方法。采用乙腈提取，Carbon-NH2固相萃取小柱凈化，氣相色譜-質譜聯用檢測后NAGINATA?軟件全智能分析，對照每個 化合物的質譜質量精度以及質譜譜圖的譜庫給出匹配度，通過保留時間鎖定對化合物作定性判斷。結果表明，18 種農藥在香菇中檢出限為0.001～0.050 mg/kg；平均回收率為77%～110%；相對標準偏差為1.1%～6.9%。應用所建立的方法對35 個市售食用菌樣品進行了篩查，檢測出2 種農藥殘留，殘留量均低于GB 2763—2014《食品中農藥最大殘留限量》的限量。該方法操作便捷、快速高效，適用于食用菌中農藥多殘留的快速篩查。

食用菌；NAGINATA?軟件；固相萃取；氣相色譜-質譜聯用；農藥殘留

食用菌營養豐富，近年來在飲食中所占比例越來越大。但是由于農藥的大量使用，使食用菌子實體受到污染，給人類的健康帶來危害［1］。因此，農藥引起的食用菌中農殘超標問題日益受到國內外重視。然而我國食品安全風險監測工作仍存在監測能力不足、風險物質篩查困難、各地區機構檢測能力差異大等問題，與發達國家仍有較大差距。近年來，在化學風險物檢測領域中，多殘留檢測已經逐漸 代替單殘留檢測，成為此領域中的主導，過程中所應用的儀器也由氣相色譜（gas chromatography，GC）［2-5］和高效液相色譜［6］為主導逐漸向GC-質譜（GC-mass spectrometry，GC-MS）［7-12］和液相色譜-質譜聯用［13-15］為主導轉變。其中GC-MS具有氣相色譜的高分辨率、質譜檢測的高靈敏度等優點，已經被許多國家認可并應用。寒梅等［16］研究了香菇中幾種氨基甲酸酯農藥殘留的GC-MS測定方法，孟曉萌等［17］通過GC-MS對杏鮑菇中16 種有機氯農藥進行快速定量定性檢測。但是現有的分析方法只是針對特定幾種或者一類農藥進行檢測，分析通量較低，而且對沒有列在分析表中的其他污染物無法進行檢測。

目前，國內研究者在對食品中風險化合物篩查的研究中通常是用標準品構建譜庫來對目標物定性和定量，或者利用已有的譜庫（NIST）定性然后用標準品制作標準曲線來定量。NAGINATA?系統軟件在GC-MS分析上，可以提供殘留農藥，環境污染物，容器包裝添加劑（塑化劑）等的多成分分析用的近1 000 種化合物的數據庫，利用數據庫和軟件自動檢出并定量化學風險物僅需2 min并且無需配制標準溶液和制作標準曲線［18-22］。Du Xu等［23］通過GC-MS結合NAGINATA?軟件對揚子江中存在的有機污染物進行了快速篩查并確定了23 種主要的生態風險有機污染物，Ishida等［24］研究了毒品中毒物的快速篩查程序，使用NAGINATA?系統軟件，不需要標準物質就能定性半定量分析藥物濃度，但是在食用菌樣品的風險物檢測領域應用較少。

本實驗利用GC-MS結合NAGINATA?軟件建立食用菌中農藥多殘留的快速篩查方法，為食用菌樣品的快速篩查提供了可靠的技術支持，所研究內容可應用于食用菌樣品突發事件的快速處置應急工作，大大縮短樣品的分析時間，提高檢測篩查的工作效率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮食用菌（香菇、杏鮑菇、金針菇等） 南京眾彩農貿市場；17 種農藥標準品（純度≥95%） 國家標準物質中心；乙腈（農殘級） 美國Tedia天地試劑公司；混合內標物（4-氯甲苯-d4（CAS號：485577-24-8）、1，4-二氯苯-d4（CAS號：3855-82-1）、萘-d8（CAS號：1146-65-2）、氘代苊（CAS號：15067-26-2）、菲-d10（CAS號：1517-22-2）、熒蒽-d10（CAS號：93951-69-0）、氘代屈（CAS號：1719-03-5）、二萘嵌苯-d12（CAS號：1520-96-3）） 純藥工業株式會社；NH2固相萃取柱（1 g，6 mL）、Florisil固相萃取柱（500 mg，6 mL）、Carbon-NH2固相萃取柱（1 g，6 mL） 美國Welch公司；無水硫酸鎂、氯化鈉、丙酮、冰乙酸。

1.2儀器與設備

7890A-5975C GS-MS聯用儀 美國安捷倫公司；固相萃取裝置 美國Supelco公司；NAGINATA?軟件 環亞高科（北京）科技發展有限公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；QL-902渦旋混合儀 海門市齊林貝爾儀器制造有限公司；JYL-D051料理機 九陽股份有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品制備

準確稱取10.00 g待測樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，勻漿提取2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，4 ℃離心10 min（4 000 r/min），將上清液旋蒸濃縮至近干，加1 mL乙腈溶解。取Carbon-NH2固相萃取柱，先用5 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）活化柱子，將上述樣品提取液過柱并收集，用2 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）分兩次洗滌梨形瓶，洗滌液并入固相萃取柱中，用10 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）洗脫并全部收集，氮吹濃縮至干，用丙酮定容至1 mL，加入2 μL混合內標物，供GC-MS分析。

1.3.2色譜條件

色譜柱：HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持2 min，以25 ℃/min升至150 ℃，以3 ℃/min升至200 ℃，以8 ℃/min升至280 ℃，保持10 min，以20 ℃/min升至300 ℃，并保持10 min；載氣：氦氣，流速1.2 mL/min；進樣量：2 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.3.3質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；MS調諧方式：DFTPP調諧；質量掃描范圍m/z：35～550；掃描速率：2.86 scan/s。

1.3.4NAGINATA?軟件分析

圖1　食用菌中18 種農藥的快速篩查方法Fig.1　Screening of 18 pesticides using NAGINATA? software

GC-MS系統狀態評價與控制：DFTPP校準→評價裝置系統性能（評估標準樣品指標見表1，各標準物質的質量濃度均為1 μg/mL）→由RTL鎖定保留時間。三元組數據庫檢出及定量：樣品1 mL中添加混合內標物2 μL→三元組數據庫自動檢出化合物并相對定量僅需2 min。多成分分析時，在測定結果的確認和驗證方面非常費時，同時也需要熟練的技巧。利用NAGINATA?軟件的手動解析瀏覽器實現了高效率的多成分分析結果的確認和驗證。每一個被檢出化合物的定量離子、確認離子的質譜色譜、樣品原始譜圖、譜庫檢索譜圖、總離子流圖等都準確的顯示在解析畫面上。食用菌中18 種農藥的快速篩查流程圖見圖1。

表1　檢測GC-MS聯用系統狀態的標準物質Table1　Standard substances used for the validation of GC-MS system

2　結果與分析

2.1SPE柱萃取條件的優化

食用菌中含有豐富的氨基酸、多糖、蛋白質和多種礦物質等營養成分，基質復雜。能否有效的去除共提取物中的基質干擾是影響食用菌風險化合物篩查方法的關鍵。在全掃描方式下對香菇的基質共提物進行分析（如圖2a所示）并確定主要干擾物為小分子干擾物（烷基和酚類）、脂肪酸類干擾物和大分子干擾物（醇類和酯類）。

以10 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）為洗脫溶劑，比較了殘留分析中常用的Florisil、NH2及Carbon-NH2柱對樣品中基質共提物的去除效果。如圖2所示，3 種固相萃取小柱均能在一定程度上去除雜質干擾，對雜質的去除作用依次增強，Carbon-NH2柱的凈化效果明顯優于Florisil和NH2柱，基質干擾效應明顯減少。并且Carbon-NH2柱凈化后18 種農藥的回收率也在73%～118%之間，相對標準偏差不大于13.3%，均符合歐盟農藥殘留分析質量控制程序要求，所以采用Carbon-NH2柱為固相萃取凈化柱。

圖2　香菇基質未經凈化和經過不同固相萃取小柱凈化后的總離子流圖Fig.2　TICs of Lentinula edodes treated with various solid-phase extractors

2.2洗脫溶劑的選擇和洗脫體積的確定

選擇極性不同的丙酮、正己烷和丙酮-正己烷（1∶1，V/V）3 種洗脫溶劑，采用1.3節的前處理方法對樣品進行回收率實驗。如圖3所示，正己烷的極性小，馬拉硫磷、敵敵畏、氧化樂果等有機磷類農藥的洗脫效果不理想，香菇中18 種農藥的回收率僅為59%～87%，相對標準偏差為2.3%～7.9%；丙酮可充分洗脫大部分農藥，香菇中18 種農藥的回收率在79%～110%之間，相對標準偏差在1.3%～7.1%之間，但由于丙酮極性較強，會同時洗脫下萃取小柱中的雜質，對后續測定造成困擾；以丙酮-正己烷（1∶1，V/V）為洗脫劑時，香菇中18 種農藥的回收率為75%～110%，相對標準偏差在1.3～6.9%之間，表明丙酮-正己烷（1∶1，V/V）溶劑能有效提取供試農藥，且相對標準偏差較小，洗脫的雜質也較少，所以本實驗最終選擇丙酮-正己烷（1∶1，V/V）作為洗脫溶劑。分別連續4 次收集5 mL洗脫液，將每一次的洗脫液分別上機測定含量。結果表明，當洗脫液總體積為10 mL時，18 種農藥的回收率均能達到80%以上，故洗脫液用量取10 mL。

圖3　洗脫溶液的選擇Fig.3　Selection of the elution solvent

2.3方法的檢出限、回收率和精密度及方法適用性

根據歐盟農藥殘留分析質量控制程序要求，農藥平均回收率需在70%～120%之間，重復性（相對標準偏差）低于20%。在香菇中添加18 種農藥的混合標準溶液，按1.3節操作步驟，進行3 個水平0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg的添加回收率實驗，每個添加水平重復5 次。結果見表2。由表2可知，本方法的添加回收率范圍為77%～110%，相對標準偏差在1.1%～6.9%之間。以3 倍信噪比確定方法檢出限為0.001～0.050 mg/kg。

采用本方法對農貿市場中購買的35 個食用菌樣品進行了分析測定，共有溴氰菊酯和氯氟氰菊酯2 種農藥檢出，含量在0.027～0.033 mg/kg之間，見表3，GB 2763—2014《食品中農藥最大殘留限量》規定食用菌中溴氰菊酯和氯氟氰菊酯的最大殘留限量分別為0.2 mg/kg和0.5 mg/kg，檢出的農藥殘留水平均顯著低于國家最大殘留限量標準。

表2　香菇中添加18 種農藥標樣的回收率、檢出限及相對標準偏差（n =5）Table2　Recovery rates with relative standard deviation （RSD）， and limits of detection of 18 pesticides in Lentinula edodes （n = 5）

表3　食用菌中農藥檢出情況Table3　Concentrations and positive rates of pesticide residues in edible mushrooms

3　腳注

本研究建立了一種采用乙腈提取，Carbon-NH2固相萃取小柱凈化，丙酮-正己烷（1∶1，V/V）溶液洗脫，GC-MS聯用檢測后NAGINATA?軟件全智能分析的快速篩查食用菌中農藥多殘留的方法。該方法檢出限為0.001～0.050 mg/kg；平均回收率為77%～110%；相對標準偏差為1.1%～6.9%，滿足歐盟農藥殘留分析質量控制程序的要求。通過對35 份食用菌樣品農藥殘留的篩查，獲得滿意的結果。與傳統方法相比無需配制標準溶液和制作標準曲線，節省時間、減少了操作過程中的人為誤差。

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Screening of Multi-Pesticide Residues in Edible Fungi by SPE and GC-MS

HU Qiuhui1， ZHANG Changjuan1， ZHENG Huihua2， QIU Weifen1， YANG Wenjian1， ZHAO Liyan3
（1. College of Food Science and Engineering， Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety， Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing 210023， China；2. Jiangsu Alphay Bio-technology Co. Ltd.， Nantong 226010， China；3. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

A gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） combined with NAGINATA? software method was developed for screening multi-pesticide residues in edible fungi. The pesticide residues in samples were extracted with acetonitrile， cleaned up with Carbon-NH2solid-phase extractor， detected by GC-MS， and fi nally analyzed by NAGINATA?software. Based on the quality precision and retention time of each compound， the possible hazardous chemical compounds were screened out by matching mass spectra with mass spectral library. Under the optimal conditions， the limits of detection（LOD） of the established method were in the range of 0.001-0.050 mg/kg， and the average recovery rates for 18 pesticide residues spik ed in a blank sample were 77%-110% with relative standard deviations （RSDs） of 1.1%-6.9%. The method was applied on 35 edible fungi purchased from local markets， and two pesticides were detected. which were below the maximum residue limit （MRL） stipulated by the Chinese national standard GB 2763—2014. This method proved to be rapid， simple，effi cient and suitable for the fast screening of pesticide residues in edible fungi.

edible fungi； NAGINATA? software； solid-phase extraction； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）；pesticide residues

O657

A

1002-6630（2015）14-0171-05

10.7506/spkx1002-6630-201514033

2015-05-08

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD36B02）；農產品中化學風險物高速分析檢測系統的引進及其創新應用項目（農業部948項目）（2015-Z47）

胡秋輝（1962—），男，教授，博士，研究方向為農產品加工與安全。E-mail：qiuhuihu@njue.edu.cn