魚肉中氟苯尼考標準樣品的制備

楊麗君，梁君妮，曹　鵬，關麗麗

（1.威海出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264200；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000）

魚肉中氟苯尼考標準樣品的制備

楊麗君1，梁君妮2，曹鵬2，關麗麗2

（1.威海出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264200；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000）

研究鯉魚魚肉基質中氟苯尼考的標準樣品制備方法。通過添加氟苯尼考養殖鯉魚獲得樣品基質，用液相色譜串聯質譜法對樣品的均勻性和穩定性進行檢測，通過8 家實驗室協作定值的方式對標準樣品進行定值和不確定度評估，結果表明樣品的均勻性良好，穩定性可達36 個月，可以用于水產品中氟苯尼考殘留檢測質量控制和相關的科研需要。

標準樣品；氟苯尼考；均勻性；穩定性；不確定度

氟苯尼考是一種新型的酰胺醇類動物專用抗生素，具有抗菌譜廣、毒副作用小、不易產生耐藥性等特點，被畜牧和水產養殖業廣泛應用［1］。氟苯尼考在體內分布較廣，半衰期長，具有胚胎毒性和耐藥性，在動物組織中殘留會嚴重危害消費者的健康與安全。隨著氟苯尼考在養殖中大量、不規范應用，它在畜禽、水產品等動物性食品中的殘留問題也日益被重視［2］。我國農業部公告規定，氟苯尼考在水產品的肌肉和皮脂最高殘留限量不得超過1 000 μg/kg；日本規定，氟苯尼考在魚類中的殘留限量不得超過200 μg/kg；美國食品藥品監督管理局規定水產品中氟苯尼考的殘留限量不得超過100 μg/kg。本研究從養殖到定值進行探討，研制了性質穩定、可長期保存的氟苯尼考凍干基體標準樣品。

目前氟苯尼考的檢測方法有高效液相色譜法、薄層色譜法、液相色譜-質譜聯用法等，在食品獸藥殘留檢測過程中，通常采用加標回收實驗作為質量控制的手段。但與實物標準樣品相比，加標回收實驗是一種模擬陽性樣品，難以反映出真正陽性樣品的提取效率，如歐盟明確要求動物源食品獸藥殘留檢測必須采用基體標準樣品進行過程質量控制。

雖然我國食品相關的標準樣品不少，但目前標準樣品主要集中于無機元素方面，含獸藥殘留標準樣品的研究較少。本研究以鯉魚為養殖對象，模擬用藥得到天然污染的原料，經制備得到氟苯尼考實物標樣，該樣品均勻、穩定，有助于對氯霉素類的藥品進行監測或作為實驗室質控樣品。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實驗用鯉魚購于市場。

氟苯尼考標準物（純度＞99.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、甲醇、正己烷（均為色譜純） 德國Merk公司；乙酸、甲酸（均為色譜純）天津市科密歐化學試劑有限公司；水為超純水。

1.2儀器與設備

1290B型高效液相色譜、G6490A三重四極桿質譜儀美國Agilent公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；Milli-Q超純水制備機 美國Millipore公司；氮吹濃縮儀 美國Organomation Associates公司。

1.3方法

1.3.1標準樣品的制備

由市場上直接購買活鯉魚，從中隨機取樣，檢測確認為陰性樣品后進行飼養。在室溫環境下養殖2 d 后，根據預先設定的藥物含量，向魚池中添加氟苯尼考，實時監控檢測水體中和魚體內的氟苯尼考含量，氟苯尼考在魚體內的含量不斷富集增高，當魚肉中的氟苯尼考含量達到預設含量時，將鯉魚捕撈至不含藥物的池中繼續養殖1 d 后捕撈。

將鯉魚宰殺，洗去血水取肌肉部分，混合攪碎制成魚糜，－70 ℃真空冷凍干燥。將冷凍干燥的魚糜粉碎后研磨過篩，用聚乙烯瓶分裝，加貼唯一性標識，常溫保存，每個瓶內樣品質量約4.0 g，共768 瓶。以備進一步做均勻性和穩定性檢測［3］。

1.3.2樣品前處理

依據GB/T 22959—2008《河豚魚、鰻魚和烤鰻中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定：液相色譜-串聯質譜法》，稱取（1.00±0.01）g魚粉樣品，置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入4.0 mL純水浸泡過夜。加入25 mL乙酸乙酯和0.75 mL氨水，超聲波混合5 min，5 000 r/min離心5 min，移取上層乙酸乙酯至25.0 mL雞心瓶中，向殘渣中再加20 mL乙酸乙酯和0.60 mL氨水，振蕩混合5 min，5 000 r/min離心5 min，合并上層乙酸乙酯相，40 ℃旋轉濃縮至近干，氮氣吹干。加入1 mL流動相（V（甲醇）∶V（水）=60∶40）定容，振蕩混合30 s，加入2 mL正己烷，振蕩1 min，除去上層正己烷，再加入2 mL正己烷，振蕩1 min，取下層水相5 000 r/min離心5 min，溶液過濾膜后供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.3液相色譜及質譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫：30 ℃；進樣體積：2.0 μL；流動相A為水，流動相B為甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.1 min，10% B；0.1～4.0 min，10%～95% B；4.0～5.0 min，10% B；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：多反應監測，電子倍增管電壓：350 V；霧化氣壓力：20 psi；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：12 L/min；毛細管電壓：3 000 V；定量離子對m/z 356/185；定性離子對m/z 356/336。

1.3.4均勻性檢驗

從制備的標準樣品中隨機抽取15 個獨立包裝，每個樣品重復測試3 次，分析樣品中氟苯尼考的含量。所有的樣品以隨機次序在重復性條件下測試，按照上述檢測方法對樣品進行均勻性檢測，檢測數據用單因素方差分析法來判斷標準樣品是否均勻［4］。

1.3.5穩定性檢驗

穩定性是標準樣品研制的關鍵，本實驗同時考察了魚肉凍干粉氟苯尼考標準樣品的短期穩定性和長期穩定性［5-8］。

標準樣品穩定性研究的基本模型是Y=β0+β1X+ε，用線性擬合模型評估標準樣品的穩定性，以x代表時間，y代表標準樣品中氟苯尼考的含量，斜率b1用式（1）計算［17］：

截距b0用式（2）計算［17］：

與斜率相關的不確定度Sb1用式（3）計算［17］：

在95%的置信水平，t臨界值用t0.95（n－2）表示，當|b1|＜t0.95（n－2）·Sb1，表明標準樣品是穩定的。

1.3.5.1短期穩定性檢驗

短期穩定性實驗進行30 d，按先密后疏選0、2、5、9、14、30 d 6 個時間點，隨機取18 瓶放于（40±2） ℃保存，模擬運輸中遇到的極端溫度，每次測量隨機選擇3 瓶，平行測定2 次，進行樣品的短期穩定性分析。

1.3.5.2長期穩定性檢驗

將樣品的存放溫度設定為（－20±2） ℃，長期穩定性實驗時間為24 個月，選6 個時間點0、3、6、12、18、24 月，每次測量隨機選擇3 瓶，平行測定2 次，進行樣品的長期穩定性分析。

1.3.6定值分析

參照CNAS—CL04：2007《標準物質標準樣品生產者能力認可準則》［9］第二部分標準物質標準樣品的定值-通用原則和統計原理，標準樣品由多個實驗室采用多種方法進行定值，本研究選擇8 家氟苯尼考檢測能力得到中國國家合格評定委員會認可的實驗室進行協作定值，每個實驗室發3 個樣品，每個樣品獨立測定2 次，定值方法為實驗室認可的檢測方法［10-12］。

2　結果與分析

2.1樣品譜圖

按前述分析方法處理樣品后，得到的選擇離子監測色譜圖（10 μg/kg）如圖1所示。由圖1可見，氟苯尼考的響應值良好，標準魚肉樣品中氟苯尼考的殘留量是適當的。

圖1　魚肉中氟苯尼考的總離子圖Fig.1　Total iron chromatograms of florfenicol in fish

2.2均勻性檢測結果

標準樣品的特性應當均勻，即在規定的細分范圍內保證其特性不變。在均勻性檢驗過程中，一般需同時考察組間均勻性及組內均勻性［13-16］，用方差分析法通過對兩者的比較來判斷各組測量值之間有無系統性差異，如果兩者的比小于統計檢驗的臨界值，則認為樣品是均勻的。均勻性檢驗結果如表1、2所示。

表1　氟本尼考標準樣品均勻性檢驗（n=3）Table1　Homogeneity test of florfenicol reference material （n= 3）

表2　氟本尼考樣品均勻性檢驗的單因素方差分析結果Table2　Results of one-way analysis of variance for florfenicol homogeneityneity

根據方差分析原理，該統計量是自由度為（v1，v2）的F分布變量。由公式v1=m－1，v2=N－m，并已知m=15，N=3×15=45；則v1=14，v2=30，F=1.672＜F0.05（14，30）=2.037，故該樣品組內及組間無顯著性差異，樣品均勻性良好，能滿足實驗要求。

2.3穩定性檢測結果

2.3.1短期穩定性

表3　氟本尼考標準樣品短期穩定性檢驗（n=6）Table3　Short-term stability test of florfenicol reference material （ n= 6）

表3是6 個時間點測得的氟苯尼考含量的數據及平均值，線性擬合模型分析結果見表4，從表4可以看出，表明氟苯尼考在（40±2）℃極端運輸條件下30 d內無明顯的降解趨勢，未觀測到不穩定性。

表4　氟本尼考標準樣品短期穩定性數據分析結果Table4　Linear model for short-term stability of florfenicol reference material

2.3.2長期穩定性

表5是6 個時間點測得的氟苯尼考含量的數據及平均值，線性擬合模型分析結果見表6，通過分析可得出故斜率是不顯著的，表明氟苯尼考在（－20±2）℃條件下24 個月內未觀測到不穩定性。

表5　氟本尼考標準樣品長期穩定性檢驗數據Table5　Long-term stability test of florfenicol reference material

表6　氟本尼考樣品長期穩定性數據的分析結果Table6　Linear model for long-term stability of florfenicol reference material

從實驗結果可以看出，魚肉凍干粉氟苯尼考標準樣品的短期穩定性和長期穩定性都很良好，完全符合標準樣品的要求。

2.4定值

8 個認可實驗室均采用液相色譜-串聯質譜法檢測，參加協同定值數據及處理結果見表7。

表7　各定值實驗室的氟苯尼考測定數據（n=6）Table7　Analytical data for florfenicol obtained by different accredited laboratories （n= 6）

將每個實驗室的數據 先用Grubb's法進行檢驗，無異常值；匯總各實驗室數據，將所有的數據按大小順序排列，進行夏皮羅-威克爾檢驗，公式見式（4）［17］

經計算W=0.959，當n=48時，P=0.947，W＞P，表明在顯著性水平α=0.05上符合正態分布。再將每個實驗室的平均值組成一組數據，用Grubb's法進行雙側情形檢驗，確定各實驗室數據無異常值；將所有數據進行下一步統計，用Cochran檢驗以確定8 個實驗室中沒有隨機誤差太大的實驗室，公式見式（5）［17］：

式中：si為各實驗室測定結果的標準偏差；smax為si中的最大值。

顯著性水平α=0.05，測定組數為8，每組測定6 次，計算C值，與Cochran檢驗臨界值C0.05（8，6）比較，經檢驗，C=0.278 8，C0.05（8，6）=0.36，C＜C0.05（8，6），表明各實驗室間的測量屬于等精度測量，匯總所有數據，計算總平均值為氟苯尼考標準樣品含量定值結果：10.17 μg/kg。

2.5不確定度評估

本標準樣品的不確定度來源主要有以下幾個方面［18-23］：標準樣品的不均勻性引入的不確定度，標準樣品的不穩定性引入的不確定度以及標準樣品定值過程中引入的不確定度。考慮到氟苯尼考標準樣品在室溫條件下有較好的穩定性，該保存條件在運輸中比較容易實現，因此在合成不確定度中可以不考慮短期穩定性不確定度分量。

由標準樣品不均勻性引入的不確定度，見表2，當組間均方MSamong＞組內均方MSwithin，不均勻性不確定度［17］ubb=Sbb。

由標準樣品不穩定性引入的不確定度，設長期穩定性保質期t為24 個月，則由長期不穩定性帶來的不確定度貢獻為：ults=Sb·t=0.009 65×24=0.231 6 μg/kg。

由定值引入的標準樣品不確定度［17］為：

經計算，uchar=0.134 5 μg/kg。

標準樣品的合成不確定度［17］公式為：

經計算，氟苯尼考標準樣品的各項不確定度如表8所示。

表8　氟苯尼考標準樣品的不確定度Table8　Uncertainty of florfenicol reference material

設置信水平為P=99%，包含因子k=3，則標準物質的定值結果為（10.17±0.93）μg/kg。

3　結 論

通過添加氟苯尼考養殖鯉魚獲得樣品基質，制備的樣品與日常檢測樣品相一致，在均勻性和穩定性均滿足標準樣品要求的前提下，通過8 家實驗室協作定值的方式對標準樣品進行定值和不確定度評估，定值結果通過有證標準物質溯源，同時制備的標準樣品穩定性可達到36 個月，滿足水產品中氟苯尼考殘留檢測質量控制和相關的科研需要。本研究樣品制備方式和標準樣品定值方法的建立，對其他獸藥殘留標準樣品的制備具有參考意義，對于建立食品獸藥殘留干粉標準樣品的國家標準具有重要意義。

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Preparation of Reference Material for the Determination of Florfenicol in Fish

YANG Lijun1， LIANG Junni2， CAO Peng2， GUAN Lili2
（1. Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Weihai 264200， China；2. Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yantai 264000， China）

A method for preparing florfenicol reference material （RM） from the muscle of common carp fish exposed to aqueous florfenicol when alive was investigated. The homogeneity and stability of the prepared sample were detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The certified value for florfenicol was based on analysis of results obtained in 8 accredited laboratories and uncertainty evaluation was conducted. The results showed that the reference material had a good homogeneity and stability within 36 months， and could be used for the determination of florfenicol residue in aquatic products.

reference material； florfenicol； homogeneity； stability； uncertainty

O657

A

1002-6630（2015）14-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201514034

2014-09-11

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK08B01）；質檢公益性行業科研專項（201310143）；國家質檢總局科技計劃項目（2013IK178）

楊麗君（1969—），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品檢測。E-mail：18663136117@163.com