MAPK信號通路在肺炎衣原體感染小鼠中的作用

吳俊等

[摘要] 目的 研究MAPK信號通路在肺炎衣原體（CP）感染APOE基因敲除（APOE）小鼠促進動脈粥樣硬化形成中的作用。 方法 48只APOE小鼠分為感染-高脂組、高脂組、感染組和對照組，每組12只，喂養20周，采用Western blot和Real time-PCR法檢測胞外信號調控激酶（p-ERK1/2）、p-P38的蛋白表達和白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）的基因的表達。 結果 感染-高脂組、高脂組、感染組APOE小鼠的主動脈IL-6和TNF-α水平明顯高于對照組（P < 0.05）。與對照組比較，感染-高脂組、高脂組、感染組p-ERK1/2、p-P38蛋白表達的水平顯著降低（P < 0.05）。 結論 CP感染激發和加重動脈內炎性反應可促進動脈粥樣硬化，MAPK信號通路是CP促進動脈粥樣硬化的潛在機制。

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化；白介素-6；絲裂原活化蛋白激酶

[中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（a）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the role of MAPK in APOE mice induced atherosclerosis （AS） by chlamydia pneumoniae （CP） infection. Methods Forty-eight APOE mice were divided into four groups including CP infection and hyperlipidemia group， hyperlipidemia group， CP infection group and control group， each group had 12 mice. The mice were sacrificed at 20 week of age. Western blot and Real time-PCR were used to detect the p-ERK1/2， p-P38 protein expression and the gene expression of IL-6， TNF-α. Results The levels of IL-6 and TNF-α in CP infection and hyperlipidemia group， hyperlipidemia group， CP infection group were significantly higher than those in control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with the control group， the levels of p-ERK1/2， p-P38 protein expression in CP infection and hyperlipidemia group， hyperlipidemia group， CP infection group significantly reduced， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion Infection with CP may contribute to AS by the initiation and progression of the inflammatory reaction within the artery. MAPK is a potential mechanism of CP induced AS.

[Key words] Atherosclerosis； IL-6； MAPK

當今心腦血管疾病的發病率呈現逐年上升的趨勢，隨著全球人口老齡化的進程和生活飲食習慣的改變，發病人群有逐年增加和年輕化的趨勢[1-2]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為心腦血管疾病的病變基礎，其發病機制至今仍不明確[3-5]。近年來國內外一些研究發現，肺炎衣原體（chlamydia pneumoniae，CP）感染可能參與動脈粥樣硬化病變的發生、發展過程[6]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK信號通路在調控心血管疾病的研究中日益受到人們的重視。筆者以往研究已經證實，CP可以加速小鼠AS的形成。在此基礎上本研究進一步探討MAPK信號通路在CP對高脂誘導的APOE小鼠AS發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物實驗及分組

48只健康雄性APOE小鼠，5周齡，體重15～18 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供[動物許可證號：SYXK（鄂）2004-0028]，飼養條件：溫度18～25℃，相對濕度50%～80%，每日光照12 h，攝食、飲水自由。普通飼料適應性喂養1周，再按照隨機化原則將APOE小鼠分為4組，每組12只。對照組：常規飼料喂養，接種0.01 mol/L，pH 7.4 PBS緩沖液；感染組：常規飼料喂養，接種CP；高脂組：高脂飼料喂養，接種0.01 mol/L，pH 7.4 PBS緩沖液；感染-高脂組：高脂飼料喂養，接種CP。

1.2 飼料配方

飼料普通飲食由同濟醫學院實驗動物中心提供。高脂飲食按照Godfrey配方：脂肪21.00%，膽固醇0.15%，基礎飼料78.85%[7]。

1.3 肺炎衣原體培養

肺炎衣原體菌株（ATCC VR-1310），購于上海慧穎生物科技有限公司，在Hep-2細胞中傳代培養，每0.5毫升凍存在-80℃冰箱至接種。接種物的濃度為1×107包涵體單位。將CP懸浮液及PBS緩沖液以鼻內途徑接種小鼠。

1.4 實驗室試劑

pH 7.4 PBS緩沖液配方：NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g將這些試劑按次序加入定量容器中，加適量蒸餾水溶解后，再定容至1000 mL，調pH值至7.4，高壓消毒滅菌后備用。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。蛋白雜交PVDF膜購自美國Intergen公司。預染蛋白質分子量標準購自Bio-Rad公司。Western雜交顯影用增強化學發光試劑購自Pierce公司。各種限制性內切酶購自大連寶生物TaKaRa公司。其余試劑為國產分析純試劑。

1.5 生化指標檢測

實驗在小鼠5、15和20周時進行，各組小鼠眼眶后竇靜脈取血于EP管中，立即在4℃下3000 r/min離心10 min，取上層血清，用生化儀行總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇檢測。

1.6 動脈標本采集

以2%戊巴比妥（30 mg/kg）經腹腔麻醉小鼠，眼球摘除法獲得血液標本，各組取5只20周小鼠用生理鹽水及4%多聚甲醛從左心室逆行灌注固定主動脈后，自主動脈根部至腹主動脈末端離斷整個主動脈。

1.7 免疫印跡法

采用Trizol試劑盒抽提純化各樣本蛋白質。①制SDS-聚丙烯酞胺凝膠緩沖液；②處理樣品；③拔出梳子，將處理好的樣品依一定次序加入點樣孔中，同時點樣Bio-Rad預染蛋白質標準5 μL作為分子量參照；④接通電源，垂直電泳分離蛋白質，開始時電壓80 V，樣品進入分離膠后電壓加大到110 V。⑤配制1×轉膜緩沖液，倒入托盤中；⑥電泳完成后，取出玻璃夾心，拆卸凝膠夾層，去除積層膠，切一塊與凝膠大小相同的PVDF膜和2張濾紙；⑦組裝轉印夾層；⑧將轉印夾夾緊，放入電泳槽中，25 V電壓下4℃轉膜過夜，將蛋白質通過電轉移轉至PVDF膜上；⑨將膜放入封閉液中室溫下封閉2～3 h；⑩TBS-T洗膜后，加入單克隆抗體（1∶2000稀釋），4℃搖動過夜；用TBS-T于室溫下洗膜4次，每次15 min；加入辣根過氧化物酶（HRPO）偶聯的羊抗兔IgG抗體（1∶8000稀釋）；采用化學發光底物進行發光顯跡。

1.8 Real-time PCR法

采用Trizol試劑盒抽提純化各樣本總RNA。采用Primer 5.0軟件設計引物，TNF-α：上游 5'-TGTTCA-TCCATTCTCTACCC-3'，下游5'-TCACTGTCCCAGC-ATCTTGT-3'；IL-6：上游 5'-AGTCACAGAAGGAGT-GGCTAAG-3'，下游5'-GAGGAATGTCCACAAACTGATA-3'；GAPDH：上游 5'-ACCACAGTCCATGCCA-TCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應體系是由7.2 μL DEPC水、10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物和2 μL cDNA組成。反應條件：95℃ 30 s預溫，95℃ 20 s、60℃ 20 s和72℃ 20 s做40個循環，72℃ 4 min退火。TNF-α含量（%）=TNF-α/GAPDH×100%；IL-6含量（%）=IL-6/GAPDH×100%。

1.9 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗過程中小鼠體重變化

感染-高脂組、高脂組、感染組和對照組小鼠5、10、15、20周體重差異無統計學意義（P > 0.05），表明對于APOE小鼠無論高脂飲食還是CP感染，對小鼠體重均無明顯影響。也就是說，AS的發生發展過程中體重不會發生顯著變化。見圖1。

2.2 各組APOE小鼠血脂水平比較

5、15周齡時各組總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平差異無統計學意義（P > 0.05）。20周齡時，高脂組和感染-高脂組總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平顯著高于對照組（P < 0.01），高密度脂蛋白膽固醇水平低于對照組（P < 0.05）；感染-高脂組的三酰甘油水平明顯高于對照組（P < 0.05），高脂組和感染組的三酰甘油水平與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；感染組各指標水平與對照組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。提示CP感染可以加重因高脂引起的AS血脂濃度。見表1。

2.3 各組20周齡動脈粥樣硬化小鼠主動脈TNF-α、IL-6 mRNA表達水平比較

感染-高脂組、高脂組、感染組APOE小鼠主動脈IL-6和TNF-α mRNA含量明顯高于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。提示高脂飲食引起APOE小鼠體內IL-6和TNF-α mRNA含量升高，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠IL-6和TNF-α mRNA水平的升高。高脂組、感染組和感染-高脂組IL-6和TNF-α mRNA水平差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2、圖2。

2.4 各組APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表達水平比較

感染-高脂組、高脂組、感染組APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表達水平均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；感染-高脂組、高脂組、感染組間差異無統計學意義（P > 0.05）。提示高脂飲食引起APOE小鼠體內p-P38和p-ERK1/2表達水平降低，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表達水平的降低。提示CP感染可能是通過減少肝臟中p-P38和p-ERK1/2的表達來促進AS的發生發展。見表3、圖3。

3 討論

AS的發生發展與炎癥相關，例如，CP、巨細胞病毒（HCMV）、幽門螺桿菌（Hp）等一些感染性因素有可能是AS的危險因子，尤其是CP感染，可促發人類心血管系統疾病的炎性反應。CP是一種嚴格細胞內寄生的病原體，通常引起上呼吸道和肺部感染[8-11]。CP經過呼吸道侵入到機體，再被單核巨噬細胞識別、吞噬，跟隨血液循環侵入血管壁，可感染內皮細胞，參與AS的發病[12-14]。

活化MAPK通過磷酸化核轉錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡的調節，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發生密切相關。MAPK在介導炎癥過程中的激活和細胞因子生成中起著重要作用。在哺乳動物細胞中MAPK亞族主要包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5，這幾條通路之間存在相互協調、相互調控的關系[15-17]。ERK通路參與應激刺激、細菌產物、炎癥介質等引起的細胞反應，表明ERK通路的激活與炎癥密切相關[18]。JNK通路能被生長因子、脂多糖（LPS）、TNF-α、IL-1、熱休克等激活。p38通路能被LPS、生血細胞因子[促紅細胞生成素（EPO）]和IL-3、致炎細胞因子、細菌成分、熱休克等激活。LPS介導的細胞炎性反應是一個典型的病原體與機體相互作用的過程。LPS刺激細胞激活ERK、JNK和P38，然后作用于各自的底物，影響多種轉錄因子的活性，從而調節包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等多種細胞因子在內的基因的表達。而TNF-α、IL-1、花生四烯酸（arachdonic acid，AA）產物、內皮素等多種炎癥介質能激活不同MAPK，通過促進或抑制基因的轉錄來調控其他炎癥介質的生成。最近，MAPK信號通路在調控心血管疾病的研究方面日益受到人們的重視[19]。

本研究表明，AS的發生發展過程中體重無顯著變化。在血脂方面，小鼠20周齡時，感染-高脂組相比于對照組差異有統計學意義。這說明CP感染可以加重因高脂引起的AS血脂濃度。感染-高脂組、感染組和高脂組APOE小鼠的主動脈IL-6和TNF-α mRNA含量明顯高于對照組（P < 0.01）。說明高脂飲食引起APOE小鼠體內的IL-6、TNF-α mRNA含量升高，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠的IL-6、TNF-α mRNA水平的升高。感染-高脂組、感染組和高脂組APOE小鼠p-P38、p-ERK1/2蛋白表達水平明顯低于對照組（P < 0.05），其三組間蛋白水平差異無統計學意義（P > 0.05）。提示高脂飲食引起APOE小鼠體內的p-P38、p-ERK1/2蛋白表達水平的降低，CP感染也可以引起或加重高脂血癥小鼠p-P38、p-ERK1/2蛋白表達水平的降低。因而，CP感染是通過減少p-P38、p-ERK1/2蛋白表達水平來促進AS的發生發展。研究表明，在CP感染APOE小鼠過程中MAPK信號轉導通路具有重要作用[20]。MAPK信號轉導通路可通過P38和ERK來促進小鼠的AS[21]。

綜上所述，筆者推測CP感染誘導APOE小鼠的AS機制可能與MAPK信號轉導通路的激活有關。但CP感染誘導APOE小鼠AS中的作用還需要進一步研究，其聯系以及相互作用機制的闡明將為探索AS有效防治途徑提供新線索。

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