熱預處理對小鼠創傷性腦損傷的神經保護作用

陳金緒　馮照善　張慶金　謝正軼　林俊華

1.廣西科技大學醫學院組胚教研室，廣西柳州545006；2.廣西科技大學醫學院解剖教研室，廣西柳州545006

熱預處理對小鼠創傷性腦損傷的神經保護作用

陳金緒1馮照善1張慶金2謝正軼2林俊華2

1.廣西科技大學醫學院組胚教研室，廣西柳州545006；2.廣西科技大學醫學院解剖教研室，廣西柳州545006

目的觀察熱預處理（HA）對小鼠創傷性腦損傷（TBI）的神經保護作用。方法60只小鼠分為正常對照（NT）組、HA組、TBI組、HA+TBI組，每組15只，采用改良自由落體損傷裝置建立小鼠TBI模型。觀察和比較各組小鼠的麻醉蘇醒時間、蘇醒后的一般行為學表現、腦組織含水量，腦切片蘇木精-伊紅（HE）染色觀察病理學改變，FJB染色觀察神經元變性情況。結果與TBI組比較，HA+TBI組的麻醉蘇醒時間縮短，腦組織含水量降低，腦組織染色顯示病理損傷程度減輕，變性神經元減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。HA+TBI組的麻醉蘇醒時間長于NT組與HA組，腦組織含水量高于NT組與HA組，差異有統計學意義（P＜0.05）。NT組與HA組的麻醉蘇醒時間和腦組織含水量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論閉合性腦損傷模型構建成功，HA對閉合性腦外傷具有神經保護作用。

熱預處理；創傷性腦損傷；神經保護作用

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是慢性致殘和致死的主要原因之一，也是我國兒童和青年的主要致殘、致死原因。腦外傷后，局部組織發生繼發性的缺血缺氧性損傷，導致神經細胞出現不可逆的損傷，另外，機械性損傷可直接損傷腦細胞，使神經元發生直接死亡或促進程序性死亡，這兩種損傷方式都可導致患者出現各種神經后遺癥。因此，對神經損傷的防治是搶救TBI的重要環節之一，應對熱預處理（HA）的保護效應進行探討。有研究顯示，機體在HA后可產生保護效應，通過交叉耐受機制，對多種應激源具有保護作用［1-2］。HA的保護效應是近年來國內外相關研究的熱點，且HA在實踐操作上更便捷，其應用價值更大。本研究采用腦外傷模型，旨在探討HA對小鼠TBI的神經保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

60只8～9周齡健康雄性C57小鼠（由廣西科技大學實驗動物中心提供，合格證編號：2005A033），體重21.3～23.5 g，采用隨機數字表法分為正常對照（NT）組、HA組、TBI組、HA+TBI組，各15只。NT組正常飼養，自由食水，照明7:00～19:00。其余3組按下述條件處理。飼養及實驗過程中遵守實驗動物管理與保護準則。

1.2方法

1.2.1HA方法將小鼠暴露于38℃的動物實驗艙內，2 h/d，不給食水，然后置于飼養環境中，連續刺激10 d。1.2.2 TBI模型的建立采用改良的自由落體撞擊損傷裝置建立小鼠TBI模型，具體方法：給小鼠腹腔注射10%（400 mg/kg）水合氯醛，麻醉起效后固定于鼠板上，碘酒消毒頭皮，沿正中線從眼部至耳后切開并分離骨膜，暴露頭骨。在冠狀縫與人字縫連線中點向右3～5 mm處標記撞擊點，使撞擊桿從3 cm高處自由下落，使小鼠發生閉合性腦損傷。為防止呼吸抑制，術后立即將小鼠置于氧氣箱中（20%O2+5%CO2）吸氧5 min，縫合頭皮，置于25℃環境中復蘇［3］。NT組和HA組不進行撞擊，其余操作相同。

1.2.3Fluoro Jade B（FJB）染色過程FJB是一種熒光染料，與變性神經元的親和力強，被認為是特異性標志變性神經元的有效方法。染色過程：經相應組別處理后的小鼠經4%多聚甲醛灌注固定，取腦組織進行冰凍切片，晾干后進行FJB染色及觀察，具體步驟如下：1%NaOH與80%乙醇混合液浸泡切片5 min→70%乙醇2 min→雙蒸水漂洗2 min→0.06%高錳酸鉀溶液15 min，在室溫置于搖床上緩慢震蕩→雙蒸水漂洗2 min→新鮮配制的0.0004%FJB（美國Chemicon公司）工作液中避光浸泡30 min→蒸餾水中漂洗3次，2 min/次→梯度脫水、透明、抗熒光淬滅劑封片→熒光顯微鏡下（激發光波長為450～490 nm）觀察并采集圖像。

1.2.4腦組織含水量測定按照實驗分組條件處理24 h后處死小鼠，快速取出全腦，剝離腦膜并稱重，隨后置于105℃烤箱中烘烤至恒重（兩次稱重質量差≤0.2 mg），按照Elliott公式計算腦組織含水量：腦組織含水量=［（濕重-干重）/濕重］×100%。

1.2.5腦組織蘇木精-伊紅（HE）染色冰凍切片固定10～30 s→稍水洗1～2 s→蘇木精液染色（60℃）30～60 s→流水洗去蘇木精液5～10 s→1%鹽酸乙醇1～3 s→稍水洗1～2 s→促藍液顯藍5～10 s→流水沖洗15～30 s→0.5%曙紅液染色30～60 s→蒸餾水稍洗1～2 s→80%乙醇1～2 s→95%乙醇1～2 s→無水乙醇1～2 s→石炭酸二甲苯2～3 s→二甲苯（Ⅰ）2～3 s→二甲苯（Ⅱ）2～3 s→中性樹膠封固→顯微鏡下觀察并攝取圖像。

1.3觀察指標

比較各組小鼠麻醉蘇醒時間（從注射麻醉劑開始至有自主活動的時間）、蘇醒后的一般行為學表現、腦組織含水量，腦切片HE染色觀察病理學改變，FJB染色觀察神經元變性情況。

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組小鼠麻醉蘇醒時間及蘇醒后一般行為學觀察

NT組小鼠的蘇醒時間為（27.5±4.7）min，HA組和HA+TBI組分別為（28.1±5.3）、（43.7±11.5）min，最后蘇醒的是TBI組小鼠，蘇醒時間為（62.9±13.7）min。NT組與HA組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示HA不會延長小鼠的麻醉蘇醒時間；HA+TBI組的蘇醒時間均顯著長于NT組和HA組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示TBI可顯著延長小鼠麻醉后的蘇醒時間；與TBI組比較，HA+TBI組的蘇醒時間明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.05），提示HA可加快小鼠麻醉后的蘇醒速度。蘇醒后，NT組和HA組小鼠很快恢復正常活動，主動進食水，HA+TBI組小鼠行動欠穩定，平衡感稍差，TBI組小鼠蘇醒后反應遲鈍，活動明顯減少，平衡能力差，提示經HA后的小鼠發生TBI時，腦損傷程度輕于未經HA的小鼠。

2.2各組小鼠腦組織含水量比較

TBI組小鼠的腦組織含水量為（82.6±2.7）%，高于HA+TBI組［（77.8±2.1）%］、HA組［（72.3±1.5）%］和NT組［（72.5±1.8）%］，HA+TBI組高于HA組和NT組，差異均有統計學意義（P＜0.05），HA組和NT組比較差異無統計意義（P＞0.05）。結果表明，TBI可導致小鼠腦組織含水量顯著升高，HA可顯著減輕TBI導致的腦水腫程度，而HA不會增加腦組織含水量。

2.3各組小鼠腦組織病理改變

各組小鼠腦組織切片HE染色結果見圖1（封四），NT組和HA組小鼠的腦組織細胞結構清晰，未觀察到細胞腫脹等明顯異常現象；HA+TBI組和TBI組可觀察到大量的細胞腫脹，胞質疏松，核明顯固縮、破裂、溶解，染色質邊集，部分細胞出現明顯空泡化，且TBI組的空泡化細胞多于HA+TBI組，細胞結構異常程度更強。

2.4各組小鼠腦組織神經元變性情況

各組小鼠腦組織切片FJB染色結果見圖2（封四），發綠色熒光的為FJB陽性細胞。NT組和HA組有少量的FJB陽性細胞，HA+TBI組和TBI組陽性細胞明顯增多，其中TBI組陽性細胞最多。

3　討論

腦外傷后，局部組織發生繼發性的缺血缺氧性損傷，導致神經細胞出現不可逆的損傷；機械性損傷可直接損傷腦細胞，使神經元發生直接死亡或促進程序性死亡，這兩種損傷方式都可導致患者出現各種神經后遺癥。因此，對神經損傷的防治是搶救TBI的重要環節之一。國內外諸多研究顯示，適當的缺血缺氧預處理可以提高腦神經細胞對后續損傷的抵抗力，熱預處理的保護效應是近年來國內外相關研究的熱點，且熱預處理在實踐操作上更便捷，其應用價值更大。

目前常用的腦外傷研究模型有液壓型、凍傷型及自由落體型。臨床上最常見的腦外傷往往是經暴力所致，最長發生在高處墜落、交通事故等撞擊事件中形成的閉合性腦損傷，因此自由落體型腦外傷模型更能代表臨床上閉合性腦損傷的形成過程及病理特征［4-5］。本組研究在經典的腦外傷動物模型構建方法基礎上，改進了自由落體裝置，選用小鼠作為實驗動物，經自由落體敲擊損傷后，動物出現一般行為和神經功能障礙表現，出現明顯腦水腫現象，且在細胞學上出現了明顯的病理改變，神經元發生變性，表明本組研究的閉合性腦外傷模型構建是成功的，其研究結果可信。

有研究表明，HA有助于增強機體對缺血缺氧的耐受能力［6-9］。諸多實驗研究結果表明，HA后，遭受缺血及缺氧/再灌注等損傷時，動物的心肌細胞損傷程度顯著低于未經HA的動物［10-12］。也有研究指出，HA可顯著減輕實驗動物發生TBI時的損傷程度，有助于臨床恢復［13-15］。但關于HA對腦損傷的保護機制，目前研究仍未闡述清楚。本研究顯示，實驗小鼠經HA后，遭受閉合性腦損傷時，其神經損傷程度明顯輕于未經HA的小鼠，主要表現在麻醉蘇醒更快，蘇醒后一般行為狀態更好，腦外傷導致的腦水腫程度減輕，細胞染色顯示病理損傷和神經元變性減輕，表明HA對閉合性腦外傷具有神經保護作用。

綜上所述，本研究能夠在一定程度上證實HA對后續腦外傷確實具有一定的保護效應，為相關研究提供了參考依據。但關于其保護作用的機制，仍有待進一步研究，故在后續研究中，可對這種保護效應的作用途徑進行探討，從而發現HA保護效應的作用靶點或相關分子信號通路，為臨床救治開拓新的方向。

［1］Horowitz M，Eli-Berchoer L，Wapinski I，et al.Stress-related genomic responses during the course of heat acclimation and its association with ischemic-reperfusion crosstolerance［J］.J Appl Physiol，2004，97（4）：1496-1507.

［2］Horowitz M.Heat acclimation and cross-tolerance against novel stressors：genomic-physiological linkage［J］.Prog Brain Res，2007，162：373-392.

［3］裴旭穎，倪康欣，周優，等.肌肽對小鼠閉合性腦損傷的保護作用［J］.浙江大學學報：醫學版，2013，42（3）：291-296.

［4］仇波，王勇，吳鵬飛，等.神經干細胞移植顯著改善腦外傷小鼠的神經功能［J］.解剖科學進展，2012，18（3）：201-204.

［5］楊瑞，羅承良，孫玉霞，等.E64d對創傷性腦損傷小鼠神經細胞的保護作用［J］.蘇州大學學報：醫學版，2011，31（2）：183-187.

［6］Sugimoto N，Shido O，Matsuzaki K，et al.Long-term heat exposure prevents hypoxia-induced apoptosis in mouse fibroblast cells［J］.Cell Biochem Biophys，2014，70（1）：1-7.

［7］楊芬，萬琪，吳松笛.熱應激小鼠腦電圖表現及腦組織的電鏡觀察分析［J］.解放軍醫學雜志，2006，31（2）：165-166.

［8］Umschwief G，Na′ama AS，Alexandrovich AG，et al.Heat acclimation provides sustained improvement in functional recovery and attenuates apoptosis after traumatic brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30（3）：616-627.

［9］Horowitz M，Assadi H.Heat acclimation-mediated crosstolerance in cardioprotection［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1188（1）：199-206.

［10］Zhou X，Zhou J，Li X，et al.GSK-3beta inhibitors suppressed neuroinflammation in ratcortex by activating autophagy in ischemic brain injury［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，411：271-275.

［11］Inan G，Ayse T，Eyyu G.Detection of traumatic brain injuriesusing fuzzy logic algorithm［J］.Exp Syst Appl，2008，34（2）：175-183.

［12］Umschweif G，Alexandrovich AG，Trembovler V，et al. Hypoxiainducible factor 1 is essential for spontaneous recovery from traumaticbrain injury and is a key mediator of heat acclimation induced neuroprotection［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（4）：524-531.

［13］Ma Y，Liu W，Wang Y，et al.VEGF protects rat cortical neuronsfrom mechanical trauma injury induced apoptosis via the MEK/ERK pathway［J］.Brain Res Bull，2011，86（5-6）：441-446.

［14］Huang RQ，Cheng HL，Zhao XD，et al.Preliminary study on the effect of trauma—induced secondary cellular hypoxia in brain injury［J］.Neurosci Lett，2010，473（1）：22-27.

［15］Galle AA，Jones NM.The neuroprotective actions of hypoxic preconditioning and postconditioning in a neonatal rat model of hypoxic-ischemic brain injury［J］.Brain Res，2013，1498：1-8.

Neuroprotective effects of heat preconditioning on mice with traumatic brain injury

CHEN Jinxu1FENG Zhaoshan1ZHANG Qingjin2XIE Zhengyi2LIN Junhua2
1.Department of Histology and Embryology，Medical College，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Liuzhou545006，China；2.Department of Anatomy，Medical College，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Liuzhou545006，China

Objective To investigate the neuroprotective effects of heat preconditioning（HA）on mice with traumatic brain injury（TBI）.Methods 60 mice were divided into normal control（NT）group，HA group，TBI group and HA+TBI group，each group of 15 mice.Free fall injury improved device was adopted to establish the mice model of TBI.The anesthesia recovery time，general behavior，brain tissue water content of mice in each group were compared and observed.Pathological change was observed by using HE staining，neuronal degeneration was observed by using FJB staining.Results Compared with TBI group，the anesthesia recovery time of HA+TBI group was shorter，brain tissue water content of HA+TBI group was lower，pathological damage of brain tissue in HA+TBI group was reduced，neuro degeneration of HA+TBI group was decreased，the difference was statistical significance（P＜0.05）.The anesthesia recovery time of HA+TBI group was longer than that of NT group and HA group respectively，brain tissue water content of HA+TBI group was higher than that of NT group and HA group respectively，the difference was statistical significance（P＜0.05）.The anesthesia recovery time and brain tissue water content of NT group and HA group were compared，with no statistical difference（P＞0.05）.Conclusion Closed TBI mice model has established successfully，and HA can offer neuroprotective effects on closed TBI.

Heat preconditioning；Traumatic brain injury；Neuroprotective effect

R651

A

1673-7210（2015）09（a）-0020-04

2015-04-21本文編輯：李亞聰）

陳金緒（1974.1-），男，碩士，主要從事組織胚胎學的教學與研究。