局部44℃溫熱治療尖銳濕疣的效果及對外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞及相關因子的影響

陳衛豐

[摘要] 目的 探討局部44℃溫熱治療尖銳濕疣的效果及對外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞）及相關因子的影響，以研究其在尖銳濕疣發病機制中的作用。 方法 選取2013年1月～2015年4月益陽市中心醫院皮膚科門診就診的尖銳濕疣患者35例（CA組），正常者35例作為對照組，CA組應用局部44℃溫熱治療，3個月后評價療效并測定治療前后外周血血清中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞和相關因子水平，并與對照組進行比較分析。 結果 CA組患者外周血CD4+CD25+Treg細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及CD4+CD25+T細胞表面抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L表達均明顯高于對照組（t = 9.52、15.07、8.63、9.16、10.92，均P < 0.05）；胞內IL-10和TGF-β陽性細胞百分比較對照組增多（t = 3.22，7.02，均P < 0.05）；CA組治療3個月，總有效率為85.71%（30/35），治療中未見明顯副作用。外周血CD4+CD25+Treg細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比、CTLA-4、GITR、PD-L水平及IL-10、TGF-β陽性細胞百分比均較治療前顯著降低，差異均有統計學意義（t = 7.76、12.91、7.46、7.68、9.29、2.64、6.01，均P < 0.05）。 結論 HPV感染可活化增殖CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞，其高表達協同刺激分子和抑制性細胞因子，溫熱治療尖銳濕疣安全有效，其治療機制可能與調節CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及相關因子有關。

[關鍵詞] 44℃溫熱；尖銳濕疣；調節性T細胞

[中圖分類號] R752.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0107-04

CD4+CD25+調節性T細胞（Treg細胞）對機體發揮免疫調節功能方面起非常重要的作用，如維持免疫自穩、調控免疫應答等。研究表明，由人類乳頭瘤病毒（HPV）引起的尖銳濕疣（CA）與其細胞免疫功能相對不足密切相關，CD4+CD25+Treg細胞調控機體對病毒感染的免疫應答主要通過抑制效應細胞的增殖和抑制細胞因子分泌，CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的局部聚集可能是皮損的CA實現免疫逃逸的機制之一[1]。近年來，局部的44℃溫熱治療被成功地應用于不同型別的HPV感染，可能通過促進朗格漢斯細胞（LC）的遷移和成熟，在局部細胞免疫應答中發揮作用[2]。本研究通過動態檢測35例CA患者在44℃溫熱治療前后CD4+CD25+Treg的表達及在調節性T細胞分化發育和功能維持中起重要作用的轉錄因子Foxp3以及負性協同刺激分子，如程序性死亡分子配體（PD-L）、細胞毒T細胞相關抗原4（CTLA-4）和腫瘤壞死因子受體（GITR）等的表達水平，以及CD4+CD25+Treg細胞內分泌的抑制性細胞因子白介素-10（IL-10）和轉化生長因子-β（TGF-β）的陽性細胞百分比，探討44℃溫熱對CA患者機體免疫功能的影響及可能作用機制，為溫熱治療尖銳濕疣提供新的理論依據和新的治療靶點。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2013年1月～2015年4月益陽市中心醫院皮膚科門診就診的經臨床確診的CA患者35例，均無復發性CA病史，35例受試者疣體數目≥5個或單個直徑≥2 cm，符合2000年原衛生部防疫司制訂的CA診斷標準[3]，其中男15例，女20例；年齡18～60歲，平均（37.45±10.58）歲；病程0.1～30個月，平均（9.63±3.51）個月。選取正常人作為對照組，共35例，其中男17例，女18例，年齡18～58歲，平均（30.78±9.41）歲。所有研究對象近2個月內沒有使用過任何免疫調節的相關藥物，排除全身衰竭、結核、肝腎疾病、腫瘤、器官移植及其他免疫性疾病。各組間年齡、性別差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。所有標本的收集均經其本人或家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法

應用中國醫科大學自主研制的溫熱治療儀（專利號ZL200720185403.3），選取靶疣進行局部44℃溫熱治療，連續治療4 d，每次60 min，1 次/d；間隔7～10 d，再連續治療3 d；間隔7～10 d，再連續治療2 d；此后每隔7～10 d進行1次治療，直至疣體消退。3個月時觀察臨床療效。

1.3 研究方法

1.3.1試劑和儀器 CD4-FITC單克隆鼠抗人抗體，CD25-PE單克隆鼠抗人抗體及同型對照IgG1-FITC，IgG1-PE，PD-L-FITC單克隆鼠抗人抗體、CTLA-4（CD152）-PE單克隆鼠抗人抗體及同型對照小鼠IgG1、IgG2α抗體和PE標記的抗人Foxp3胞內染色試劑盒均購自eBioscience公司。流式細胞儀為Beckman公司產品（型號：EPICS-XL）。人IL-10、人TGF-β1酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒為eBiosource公司產品。淋巴細胞分離液（AXIS-SHIELD公司）。MagCellectTM人CD4+CD25+Treg細胞免疫磁珠分選試劑盒購自R&D公司。

1.3.2 CD4+CD25+T細胞的分離純化 用90 μL緩沖液調整外周血單個核細胞（PBMC）為1×108/mL，再加入CD25磁珠標記抗人CD25單抗10 μL，置4℃冰箱孵育15 min，過MS柱分選，收集流下來的細胞懸液和洗柱液，陽性選擇獲得CD4+CD25+Treg細胞，重復上述操作，以增加細胞的純度。經流式細胞儀分析，其純度>85%。

1.3.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞染色 采用淋巴細胞分離液（AXIS-SHIELD公司）經密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，用含10%的小牛血清的培養基RPMI 1640調細胞至1×106/mL，取200 μL細胞懸液加入抗CD4-PE、CD25-FITC單克隆抗體各20 μL，同型對照分別為IgG1-FITC，IgG1-PE，混勻，室溫避光孵育20～30 min，加2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，4℃，1500 r/min離心5 min，棄上清，加2%正常大鼠血清100 μL，避光封閉20 min，以減少非特異性熒光吸附，再加入PE標記抗人Foxp3抗體10 μL，避光孵育20～30 min，加2 mL PBS緩沖液洗滌2次，將細胞懸浮于0.5 mL PBS洗滌液中，振蕩混勻后上機檢測。

1.3.4 CD4+CD25+Treg細胞膜分子熒光染色 采用全血熒光抗體直接染色法[3]，取2管EDTA抗凝全血100 μL，置12 mm×75 mm專用塑料試管中，加入20 μL特異性熒光單抗，另一份加入熒光標記的無關單抗作為同型對照，室溫下避光染色15 min。然后加入溶血素2 mL溶解紅細胞、穩定和固定白細胞，靜置5 min，4℃，1500 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次，最后加入1%多聚甲醛300 μL固定后上機檢測。

1.3.5 CD4+CD25+Treg細胞內細胞因子IL-10和TGF-β的檢測 具體方法參見文獻[4]：取上述凍存PBMC培養上清，采用ELISA法檢測上清中IL-10和TGF-β水平，按試劑盒提供的說明書進行操作。

1.4 療效標準

治愈：外陰尖銳濕疣疣體全部脫落，臨床癥狀消失，宮頸HPV-DNA復查結果為陰性。顯效：宮頸HPV-DNA復查結果為陰性或弱陽性，外陰尖銳濕疣疣體脫落70%以上。無效：HPV-DNA復查結果為陽性或強陽性，外陰尖銳濕疣疣體無改變或無明顯脫落。總有效率=（治愈例數+顯效例數）/總例數×100%。以3個月為治療終點，計算總有效率。

1.5統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

CA患者經局部44℃溫熱治療3個月后，總有效率達85.71%（30/35），治療中未見明顯副作用。

2.1 兩組外周血CD4+CD25+Treg細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞、抑制性膜分子和細胞因子表達水平的比較

CA組患者CD4+CD25+Treg細胞、CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L表達水平均顯著高于對照組（均P < 0.05）；CA組患者IL-10及TGF-β的陽性細胞數比對照組明顯增多（均P < 0.05）。見表1。

2.2治療前后CA患者外周血CD4+CD25+Treg細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞、抑制性膜分子和細胞因子表達水平比較

治療后外周血CD4+CD25+Treg細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞、CTLA-4、GITR、PD-L水平及IL-10、TGF-β陽性細胞數較治療前顯著下降（均P < 0.05）。見表2。

3 討論

大量研究表明，免疫系統在人乳頭瘤病毒引起的相關疾病結局上起重要作用，HPV持續感染的重要機制是全身或局部細胞免疫功能缺陷，病損局部主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ和MHCⅡ分子的下調，導致惡性變[1-4]。近年隨著對CD4+CD25+Treg各種生物學特性和功能的進一步研究，CD4+CD25+Treg細胞表面表達CD25、CTLA-4、GITR和PD-L等膜分子，其特征性的分子標記是Foxp3+，發現HPV感染很可能存在Treg異常，如HPV病損局部可有CD4+CD25+Foxp3+ Treg高表達，也不具有MHC限制性，主要通過細胞間直接接觸和分泌抑制性膜分子IL-10和TGF-β發揮免疫抑制功能，免疫抑制環境主要由局部低表達細胞因子IL-2、IFN-γ和TGF-β、IL-10高表達形成。CD4+CD25+Treg細胞是一種新型免疫抑制調節細胞，機體對病毒感染的免疫應答主要通過抑制增殖效應細胞和分泌細胞因子來調控，CD4+CD25+Treg細胞免疫抑制效應可能在CA的發病機制中發揮重要作用[5]，提示刺激HPV發生特異性免疫反應可通過抑制或去除Treg細胞來達成，從而抑制HPV的持續慢性感染。隨著熱療技術的相關原理研究進一步深入，以及對溫度測定、控制和加熱技術的不斷進步，熱療技術在臨床上得到了廣泛的應用。近年來，溫熱被廣泛應用于各種病毒疣的治療，并且取得了良好的療效，但其具體的作用機制尚不明了[6-7]。有研究表明，44℃溫熱能夠促進LC成熟、遷移，并且增強其抗原提呈能力，LC能通過真皮層向局部淋巴結遷移，誘導病毒疣局部細胞發生免疫應答，從而對病毒感染引起的病毒疣發揮有效作用[8-9]。

本研究結果表明，CA患者CD4+CD25+ Treg細胞、轉錄因子Foxp3+及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L表達均比對照組顯著增高（P < 0.05）；CA組CD4+CD25+T細胞內分泌IL-10及TGF-β的陽性細胞數比對照組明顯增多，說明機體免疫功能受到明顯抑制，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及相關因子共同參與了尖銳濕疣的發生發展，CA患者高表達CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數，可誘導其增殖活化，同時高表達轉導抑制信號的負性協同刺激分子CTLA-4、GITR及PD-L，其表達水平可以反映Treg細胞功能的強弱，通過某種機制抑制機體免疫功能的影響，這在尖銳濕疣發病機制中起重要作用[10]。也有學者指出，Treg細胞可以通過直接接觸和分泌抑制性因子IL-10及TGF-β發揮免疫抑制和感染耐受的雙重作用[11]。尖銳濕疣發生及持續感染的重要機制之一在于機體不能產生有效的免疫保護作用[12]，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞通過抑制CD4+和CD8+細胞的IL-2基因轉錄和表達來抑制T細胞的活化增殖，使局部微環境處于免疫抑制或耐受狀態，Foxp3+Treg細胞通過TGF-β在促進自身增殖分化同時抑制Th1和Th2分化，從反向抑制了機體局部抗病毒免疫應答[13]，形成尖銳濕疣持續感染，促進了尖銳濕疣生長和發展。有研究表明，CA患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞含量明顯增高，且復發患者顯著高于初發患者，提示尖銳濕疣患者存在有一定程度上病毒特異性細胞免疫受損，而細胞免疫功能水平直接影響尖銳濕疣HPV感染的病程及其疾病的轉歸，通過抑制或去除Treg細胞來刺激HPV特異性免疫反應，從而抑制HPV慢性感染[14]。局部44℃溫熱治療3個月，治愈率達85.71%，治療中未見明顯副作用，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數量、CTLA-4、GITR、PD-L、IL-10和TGF-β水平顯著下降（P < 0.05），表明溫熱能夠有效治療HPV感染尖銳濕疣病，這可能與協助增強機體免疫功能有關。溫熱治療疣體的說法不一，有些研究者認為病灶組織與正常組織相比，對溫熱更敏感[15]，熱損傷后更不易恢復[16]，有些則推測可能是溫熱引起病變組織壞死。研究發現，44℃溫熱治療尖銳濕疣病后，機體可抑制CD4+CD25+Treg細胞增殖活化，負性調節刺激分子CTLA-4、GITR、PD-L以及抑制性細胞因子IL-10、TGF-β，推測其機制可能為促進了局部免疫調節作用，引起靶疣局部LC向附近淋巴結遷移和增強抗原提呈功能，從而促成特異性免疫應答的建立，破除由局部高表達IL-10和TGF-β形成的免疫抑制環境，抑制免疫逃逸機制以清除HPV病毒[2，17]。

綜上所述，本研究認為，44℃溫熱治療尖銳濕疣具有較好的臨床療效，能有效調節機體的免疫功能，其治療機制可能與調節CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及相關分子有關，值得臨床進一步推廣應用。

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（收稿日期：2015-04-14 本文編輯：任 念）