Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、活動(dòng)水平下降和糖代謝異常

孫　敏，沙海波，屠　鑫，鄒耩歡，賴貝貝，高　翔，齊　心

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，上海200025；2. 南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210061）

·論著·

Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、活動(dòng)水平下降和糖代謝異常

孫敏1，2，沙海波2，屠鑫2，鄒耩歡2，賴貝貝2，高翔1，2，齊心2

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，上海200025；2. 南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210061）

目的建立核異質(zhì)核糖核蛋白U（hnRNP U）基因全身性敲除小鼠模型，研究該基因在小鼠體內(nèi)的功能。方法通過(guò)同源重組的方法建立hnRNP U全身性敲除的小鼠模型。觀察統(tǒng)計(jì)小鼠的出生以及生長(zhǎng)情況，檢查其組織器官發(fā)育，通過(guò)代謝籠檢測(cè)其代謝水平，并用糖耐量試驗(yàn)檢測(cè)其糖代謝變化。結(jié)果hnRNP U全身性敲除純合子小鼠（Hnrnpu-/-）死于胚胎期7.5 d前，而其雜合子小鼠也有部分在胚胎期死亡，出生的雜合子小鼠表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、部分組織的重量減輕、骨密度降低以及肌肉含量減少。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，Hnrnpu+/-小鼠夜間進(jìn)食量、活動(dòng)水平和產(chǎn)熱量等降低，糖代謝能力下降。結(jié)論通過(guò)同源重組方法成功建立hnRNP U全身性敲除小鼠模型，并在整體水平證實(shí)了該基因在小鼠發(fā)育和代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起重要作用。

核異質(zhì)核糖核蛋白U（hnRNP U）；基因敲除；發(fā)育遲緩；代謝異常；糖代謝

核異質(zhì)核糖核蛋白U（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U，hnRNP U）也被稱為腳手架附著因子A（scaffold attachment factor A，SAF-A），是最早被發(fā)現(xiàn)是在HeLa細(xì)胞廣泛表達(dá)的核腳手架成分之一［1］。它作為核異質(zhì)核糖核蛋白家族中的一員［2］，對(duì)細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)有廣泛作用，包括與RNA聚合酶II形成剪切復(fù)合體調(diào)節(jié)核內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)pre-mRNA的加工以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA翻譯過(guò)程起作用等等［3］。hnRNP U由825個(gè)氨基酸組成［4］，其中N端富含酸性殘基（被稱為骨架附著區(qū)），是DNA結(jié)合區(qū)域，而C端包含一個(gè)由26 個(gè)氨基酸構(gòu)成的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域富含甘氨酸，天冬氨酸和精氨酸［5，6］，是RNA結(jié)合位點(diǎn)［7］。

hnRNP U對(duì)前體mRNA的剪切有重要調(diào)節(jié)作用。它與snRNA形成的復(fù)合物是前體-mRNA內(nèi)含子剪切所必須的［8，9］。hnRNP U能被招募到X染色體上從而幫助Xist附著X染色體上，該過(guò)程對(duì)X染色體失活起著重要作用［10］。另外，hnRNP U還參與細(xì)胞中其他重要的生理和生化活動(dòng)［11，12］。其對(duì)DNA有絲分裂中極光激酶A（Aurora-A）和紡錘體的附著［13］、肢端發(fā)育中的音猬因子（Shh）表達(dá)［14］、mRNA的穩(wěn)定［15］和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［16］等方面起著重要作用。Hnrnpu在人類中位于一號(hào)染色體長(zhǎng)臂44位點(diǎn)，由14個(gè)外顯子組成。在一些說(shuō)話遲緩、癲癇、智障、頭小畸形、顱面畸形、四肢異常，以及深度檢查（核磁共振和基于比較基因組單核苷酸序列分析）之后發(fā)現(xiàn)大腦胼胝體異常的病人中，都檢測(cè)到它們位于1號(hào)染色體上的包含了Hnrnpu的這一段基因是缺失的［17］。 Caliebe 等［18］和 Zaki 等［19］也觀察到Hnrnpu的類似的缺失。

盡管已有報(bào)道表明，hnRNP U在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和活動(dòng)方面有重要作用，但是關(guān)于其體內(nèi)功能的研究還不是很清楚。作者通過(guò)同源重組基因打靶的方法，得到了Hnrnpu全身性敲除小鼠并研究了hnRNP U的體內(nèi)功能。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所用小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供［SCXK（蘇）2010-0001］ 并在南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的準(zhǔn)則下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠均為C57BL/6背景的SPF級(jí)，并用普通飼料飼養(yǎng)在12 h明/暗周期中［SYXK（蘇）2010-0003］。實(shí)驗(yàn)中所用的小鼠年齡和性別均在圖例中說(shuō)明。

1.2Hnrnpu+/-打靶載體的構(gòu)建及敲除小鼠制備

使用細(xì)菌人工染色體（BAC）套取的方法構(gòu)建了基因打靶載體［20］。包含Hnrnpu基因的 129/S6 BAC克隆來(lái)自于英國(guó)桑格研究所。作者通過(guò)包含兩個(gè)同源臂的套取載體套取得到Hnrnpu 基因。5' loxP位點(diǎn)被導(dǎo)入基因的第三個(gè)外顯子上游，3' loxP位點(diǎn)（包含frt-Neo-frt篩選標(biāo)記）位于基因第5個(gè)外顯子的下游。打靶載體包含一個(gè)胸苷激酶（thymidine kinase）作為符篩選標(biāo)記。

Hnrnpu基因打靶載體用Not I線性化后電轉(zhuǎn)到小鼠全能干細(xì)胞中。經(jīng)過(guò)G418抗性的篩選得到克隆并進(jìn)行PCR篩選。篩選得到發(fā)生同源重組的G-418抗性的克隆將經(jīng)過(guò)southern blot進(jìn)行驗(yàn)證［20］。接著，驗(yàn)證后的克隆顯微注射到C57BL/6J囊胚中以得到嵌合小鼠。將嵌合小鼠和C57BL/6J交配，并對(duì)產(chǎn)生的子代小鼠進(jìn)行基因鑒定來(lái)驗(yàn)證性腺傳遞并得到Hnrnpuflox/+小鼠。為了進(jìn)一步敲除Hnrnpu基因，作者將Hnrnpuflox/+小鼠與全身表達(dá)Cre環(huán)化重組酶的EIIa-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（a germ cell-specific Cre line，# 003314，JAX lab，USA）進(jìn)行繁育。PCR鑒定Cre介導(dǎo)Hnrnpu基因第4到第6個(gè)外顯子的敲除。

1.3小鼠的身體成分和骨密度的分析

為了獲得小鼠的身體成分，作者通過(guò)雙能X射線吸收（DEXA）系統(tǒng)（GE Medical System Lunar，Madison，WI）進(jìn)行小鼠全身的測(cè)量。脂肪含量，瘦肉含量和骨密度是去除了頭和尾的計(jì)算值。腦、心、脾、腎、睪丸和附睪等組織的重量是通過(guò)分離各個(gè)組織后稱重得到的。

1.4代謝實(shí)驗(yàn)

小鼠單只飼養(yǎng)在綜合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（CLAMS system）（Columbus Instruments，USA）中進(jìn)行小鼠進(jìn)食、活動(dòng)、氧氣消耗、二氧化碳產(chǎn)出和產(chǎn)熱量的測(cè)量。光照和飲食都與正常飼養(yǎng)條件一致。

1.5葡萄糖耐耐量試驗(yàn)

通過(guò)葡萄糖耐量試驗(yàn)（GTT）檢測(cè)小鼠的糖代謝的能力。所有血樣來(lái)自于小鼠的尾部。使用京都1640血糖儀（Super Glucocard II，Arkray，Japan）對(duì)小鼠的血糖值進(jìn)行測(cè)量。GTT中，小鼠禁食16 h后腹腔注射2 g/kg D-（+）-葡萄糖并且在0 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min后檢測(cè)血糖變化。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，n為小鼠的數(shù)量。組間比較通過(guò)雙尾t-檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Hnrnpu全身性敲除純合子小鼠是胚胎致死的

將與Hnrnpu+/-雄鼠交配后妊娠的Hnrnpu+/-雌鼠子宮內(nèi)的胚胎取出進(jìn)行基因鑒定分析，發(fā)現(xiàn)從胚胎期7.5 d到11.5 d都沒(méi)有純合子的胚胎，只有雜合子和野生型的小鼠胚胎（表1）。另外，出生的Hnrnpu-/-小鼠的比例和胚胎的比例都明顯低于孟德爾遺傳定律的比例（表2）。這些結(jié)果表明，Hnrnpu全部缺失或者一半缺失都影響了小鼠的正常存活。

2.2Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩

發(fā)現(xiàn)出生后8 d的Hnrnpu+/-小鼠看上去比同窩野生型小鼠小（圖1 A）。通過(guò)跟蹤測(cè)量從出生后一周到五個(gè)月雄鼠的體長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)Hnrnpu+/-小鼠從出生后就明顯的比同窩野生型小鼠小，在一周時(shí)只有野生型雄鼠體長(zhǎng)的90%左右，到了五個(gè)月時(shí)增加到野生型雄鼠體長(zhǎng)的93%（圖1 B）。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)了從小鼠離乳（3周齡）到3月齡時(shí)小鼠體質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)Hnrnpu+/-雄鼠，離乳時(shí)就明顯比同窩野生型小鼠要輕（圖1 C）。通過(guò)X光射線檢測(cè)小鼠的脛骨長(zhǎng)度，也發(fā)現(xiàn)Hnrnpu+/-小鼠的脛骨長(zhǎng)度比野生型小鼠的脛骨要短（圖1 D）。

表 2　Hnrnpu+/-雄鼠和C57BL/6J雌鼠交配得到的出生后代的基因型統(tǒng)計(jì)

表 1　Hnrnpu+/-雄鼠和Hnrnpu+/-雌鼠交配得到的胚胎的基因型統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)了Hnrnpu+/-成年雄鼠的各個(gè)組織器官的重量后發(fā)現(xiàn)，除了肝臟外，Hnrnpu+/-成年雄鼠的其他組織（腦、心、脾、腎、睪丸和附睪）的重量明顯低于同窩野生型對(duì)照的重量（圖1 E）。通過(guò)與小鼠體質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn)，Hnrnpu+/-成年雄鼠的腦重體質(zhì)量比明顯比同窩野生型的要大，但是其睪丸重量體質(zhì)量比卻明顯小于同窩野生型小鼠（圖1 F）。

2.3Hnrnpu+/-小鼠有較低的骨密度及瘦肉含量

通過(guò)X光透射檢測(cè)小鼠的骨骼形態(tài)是否異常，發(fā)現(xiàn)Hnrnpu+/-小鼠（不管是雄鼠還是雌鼠）在骨骼的形態(tài)或者不對(duì)稱發(fā)育方面與同窩野生型對(duì)照小鼠相比并沒(méi)有明顯的差異（圖2 A）。但是，不管是雄性還是雌性，成年的Hnrnpu+/-小鼠的骨礦物質(zhì)含量都明顯的低于同窩野生型對(duì)照小鼠（圖2 B）。同時(shí)，其骨礦物質(zhì)密度也明顯的比對(duì)照小鼠要低（圖2 C）。小鼠的體內(nèi)脂肪和瘦肉含量，脂肪含量和比例在成年的Hnrnpu+/-小鼠和同窩野生型對(duì)照小鼠中并沒(méi)有顯著的差異（圖2D）。但是，成年的Hnrnpu+/-小鼠的瘦肉含量卻明顯低于同窩野生型對(duì)照小鼠（圖2 E）。這些結(jié)果表明，Hnrnpu+/-小鼠有較低的骨密度和瘦肉含量。

圖 1　Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩

圖 2　Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)有降低的骨密度及瘦肉含量

2.4Hnrnpu+/-小鼠夜間代謝和活動(dòng)水平降低

實(shí)驗(yàn)表明，Hnrnpu+/-小鼠的氧氣消耗與同窩野生型對(duì)照小鼠相比沒(méi)有明顯的區(qū)別（圖3 A）。其總的二氧化碳產(chǎn)生與同窩野生型對(duì)照小鼠相比也沒(méi)有明顯的差異，但是在晚上的時(shí)候有顯著的減少（圖3 B）。反應(yīng)小鼠能量消耗途徑的呼吸熵并沒(méi)有明顯的區(qū)別（圖3 C）。Hnrnpu+/-小鼠總的進(jìn)食量與野生型對(duì)照相比并沒(méi)有明顯區(qū)別。但是，Hnrnpu+/-小鼠在夜間的進(jìn)食量明顯比同窩野生型對(duì)照小鼠要少，大約只有野生型對(duì)照的72%（圖3 D和E）。同時(shí)其活動(dòng)量在晚上也是比對(duì)照小鼠明顯的減少了（圖3 F和G）。Hnrnpu+/-小鼠的總體產(chǎn)熱水平也明顯少于比野生型對(duì)照的量，尤其是在夜間，只有野生型的83%（圖3 H 和I）。這些結(jié)果表明，Hnrnpu單倍劑量不足影響小鼠代謝活動(dòng)的穩(wěn)態(tài)，尤其是對(duì)夜間小鼠的攝食和活動(dòng)水平有顯著的抑制作用。

圖 3　Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)出夜間代謝水平降低

2.5Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)出變差的糖代謝能力

結(jié)果表明，Hnrnpu+/-成年雄鼠在腹腔注射了2 g/kg的葡萄糖之后，從30 min開始，其血糖值要明顯高于野生型對(duì)照鼠，一直到120 min才逐漸下降至野生型小鼠的血糖值水平（圖4 A）。這說(shuō)明Hnrnpu+/-雄鼠的清除血糖的能力明顯變差了。同樣，在Hnrnpu+/-成年雌鼠也有同樣的糖代謝變差的異常（圖4 B）。這些結(jié)果表明，Hnrnpu單倍劑量不足降低了小鼠的糖代謝的能力。

3　討論

本文作者首次建立了核異質(zhì)核糖核蛋白U （hnRNP U）基因全身性敲除的小鼠模型。作者發(fā)現(xiàn)，Hnrnpu-/-小鼠死于胚胎期7.5 d前，而Hnrnpu+/-小鼠也有部分胚胎死亡，出生后的雜合子小鼠表現(xiàn)明顯的發(fā)育遲緩。其表現(xiàn)出若干個(gè)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（Ataxia-telangiectasia，A-T）的特點(diǎn)，包括發(fā)育遲緩、活動(dòng)水平的降低和血糖代謝能力的不足等。這些結(jié)果表明，hnRNP U對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育，活動(dòng)的調(diào)節(jié)和代謝的穩(wěn)態(tài)體起著至關(guān)重要的作用。

圖 4　Hnrnpu+/-小鼠糖代謝能力下降

Roshon和Ruley［21］觀察到hnRNP U突變的純合子小鼠胚胎致死。早在胚胎期6.5 d，純合子突變胚胎開始出現(xiàn)生長(zhǎng)異常。到了7.5 d，突變胚胎較小于對(duì)照胚胎（主要表現(xiàn)為欠發(fā)育的胚胎外胚層）。最后這些突變的胚胎在發(fā)育的第10日被吸收。而之前的報(bào)道表明，Hnrnpu點(diǎn)突變的純合子死于胚胎期。作者的結(jié)果與之一起證實(shí)了hnRNP U對(duì)小鼠早期的胚胎發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。

為了解釋Hnrnpu+/-小鼠的表型，作者首先考慮Hnrnpu在mRNA剪切過(guò)程中的重要作用。hnRNP U通過(guò)RNA聚合酶II結(jié)合形成剪切復(fù)合體，能夠確保正確的外顯子的剪切，從而來(lái)減少錯(cuò)誤的mRNA的合成。大約有一半的可變剪切的前體mRNA是由核異質(zhì)核糖核蛋白家族來(lái)完成這個(gè)過(guò)程，當(dāng)然也包括hnRNP U。hnRNP U可能通過(guò)調(diào)節(jié)下游重要基因的mRNA剪切從而影響小鼠的發(fā)育和代謝活動(dòng)，hnRNP U還可以調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（SMN）的剪切從而影響新生兒的脊髓性肌萎縮。在作者的研究中，Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)了肌肉減少和活動(dòng)下降，這和SMN基因的剪切受抑制引起的脊髓性肌萎縮相吻合。這暗示，hnRNP U單倍劑量不足就可以導(dǎo)致SMN的剪切問(wèn)題從而導(dǎo)致肌肉的發(fā)育障礙。另外，hnRNP U還可以調(diào)節(jié)Caspase 9a 和Caspase 9b的剪切比例影響細(xì)胞的凋亡過(guò)程。作者的結(jié)果表明，Hnrnpu+/-小鼠表現(xiàn)了組織發(fā)育的缺陷，并表現(xiàn)有增加的凋亡細(xì)胞（數(shù)據(jù)未列出）。這很可能是由于hnRNP U單倍劑量不足引起Caspase 9a 和Caspase 9b的剪切比例從而引起的凋亡增加。這些分子機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步確認(rèn)和研究。

總之，作者的工作揭示了hnRNP U是小鼠體內(nèi)組織發(fā)育、活動(dòng)調(diào)節(jié)和糖代謝穩(wěn)態(tài)等活動(dòng)所必需的。這為證實(shí)Hnrnpu在小鼠發(fā)育的調(diào)節(jié)和維持代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用提供了體內(nèi)的證據(jù)，為研究人類發(fā)育遲緩和代謝等疾病（如A-T）提供了很好的疾病模型。

（致謝: 感謝張明坤，朱權(quán)鳳和王桂琴在載體構(gòu)建和小鼠繁育方面的幫助）。

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hnRNP U Haploinsufficiency Leads to Growth Retardation，Decreased Activities and Abnormal Glucose Metabolism in Mice

SUN Min1，2，SHA Hai-bo2，TU Xin2，ZOU Jiang-huan2，LAI Bei-bei2，GAO Xiang1，2，QI Xin2
（1. Department of Medical Genetics Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai，200025. China；2. MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study，Model Animal Research Center，Nanjing University，Nanjing 210061，China）

ObjectiveTo establish a heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U （HnRNP U） knockout mouse model and study the roles of hnRNP U in vivo. MethodsThe Hnrnpu conventional knockout mouse model was established by homologous recombination. The roles of hnRNP U in vivo were studied by growth analyses，body and tissues weighting，metabolic analyses and glucose tolerance tests. ResultsThe Hnrnpu-/-mice are embryonic leathal before embryonic day 7.5. The Hnrnpu+/-mice were partially died at embryonic stage and the viable individuals showed growth retardation with decreased tissues weight，bone mineral density and lean mass compared with wild-type littermates. In addition，hnRNP U haploinsufficiency leads to decreased activity and food intake at night and impaired glucose homeostasis. ConclusionHnrnpu knockout mouse model was successfully established and hnRNP U played a great role in a diverse group of cellular processes，including the normal growth of somatic tissues，metabolic activities and glucose metabolism.

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U （hnRNP U）；Knockout；Growth retardation；Metabolic disorder；Glucose metabolism

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.001

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0175-07

2014-09-26

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2011CB944104）和國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAI15B02；2012BAI39B01）

孫敏（1989-），女，碩士，研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)，E-mail: sunmin@nicemice.cn

齊心，博士，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，E-mail: qixin@nicemice.cn