表達新城疫病毒血凝素神經氨酸酶（HN）基因重組鴨腸炎病毒的構建

梁殊林，李慧昕，陳洪巖，劉勝旺，

（1. 東北農業大學 生命科學學院，哈爾濱 150030；2. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 禽呼吸道病創新團隊，哈爾濱 150001；3. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 實驗動物中心， 哈爾濱 150001）

表達新城疫病毒血凝素神經氨酸酶（HN）基因重組鴨腸炎病毒的構建

梁殊林1，李慧昕2，陳洪巖3，劉勝旺1，2

（1. 東北農業大學 生命科學學院，哈爾濱 150030；2. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 禽呼吸道病創新團隊，哈爾濱 150001；3. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 實驗動物中心， 哈爾濱 150001）

目的構建表達新城疫病毒血凝素神經氨酸酶（HN）基因的重組鴨腸炎病毒（DEV）。方法利用同源重組技術，在DEV Clone-03基因組中胸苷激酶（TK）基因內部插入新城疫病毒HN基因。以本實驗室已構建的rDEV TK-EGFP株為親本病毒，將病毒基因組與轉移載體共轉染及蝕斑純化，獲得表達新城疫病毒HN基因的重組鴨腸炎病毒。結果重組病毒經基因水平和蛋白水平的鑒定，證明新城疫病毒HN基因正確插入DEV基因組內部且有效表達；復制動力學和遺傳穩定性檢測，證明重組病毒rDEV TK-HN滴度略有下降，但復制趨勢與親本病毒一致；在雞胚成纖維細胞（CEF）和SPF雞胚連續傳代20代，表明HN基因隨病毒傳代而穩定遺傳、表達。結論利用同源重組技術，對鴨腸炎病毒基因組進行修飾，構建了TK基因缺失表達新城疫病毒HN基因的重組鴨腸炎病毒，該病毒能夠攜帶HN基因穩定遺傳和表達。

鴨腸炎病毒（DEV）；新城疫病毒（NDV）；血凝素神經氨酸酶（HN）基因；重組病毒；基因修飾

鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE），又稱鴨瘟（Duck plague，DP），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鴨、鵝等雁形目禽類的一種急性、熱性和敗血性傳染病。其特征是流行廣泛，傳播迅速，發病率和死亡率很高［1］。該病于1923年由Baudet首次在荷蘭報道［2］，隨后相繼發現于法國、美國、印度、比利時、英國、泰國和加拿大，我國于1957年在廣州首次發現本病，此外該病在南京、上海、武漢等地也有流行［3，4］。根據作者研究組的流行病學調查，在山東免疫后的鴨群中仍有鴨病毒性腸炎的爆發［5］，給養鴨業造成了巨大的經濟損失。

近年來，新城疫對鴨的感染呈上升趨勢，我國不斷有鴨發生新城疫（Newcastal disease）或從野鴨分離到新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）的報道。2005在河北省某鴨場的維鴨感染了新城疫［6］，證明了家鴨也能感染NDV并引起發病。2006年蔡麗姬等［7］從江蘇某生態自然保護區發病的野鴨中成功分離到3株鴨新城疫毒株。2006年石躍等［8］從黑龍江三江自然保護區野生綠頭鴨的泄殖腔拭子樣品分離到一株基因Ⅲ型的野鴨NDV。這些都對我國養鴨業造成巨大危害。

DEV基因組中有多個復制非必需基因，可容納外源基因的插入［9，10］。本研究對DEV基因組進行基因修飾，將其基因組中胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因插入缺失，插入新城疫病毒的血凝素神經氨酸酶（HN）基因。NDV HN蛋白位于病毒粒子囊膜外表面，兼具有HA和NA兩種活性即具有識別細胞膜上的唾液酸受體并與之結合以及破壞這種結合的活性［11，12］。構建TK基因缺失表達NDVHN基因重組鴨腸炎病毒，通過病原的基因修飾，改變病原的基本生物學特性，以期建立能夠同時檢測鴨腸炎病毒和新城疫病毒的的檢測方法，為實驗用鴨的疫病凈化檢測奠定基礎。

1　材料與方法

1.1病毒、細胞與雞胚

重組鴨腸炎病毒rDEV TK-EGFP由本實驗室構建，DEV Clone-03由本實驗室保存。9～10日齡SPF雞胚由哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供。

1.2質粒與菌種

載體PMD18-T simple購自大連寶生物公司，攜帶NDV HLJ-1-06株病毒HN基因的質粒pUS10-HN由本實驗構建。感受態由本實驗室制備。

1.3酶類與主要生化試劑

ExTaq DNA聚合酶、HS PrimeStar高保真酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA聚合酶、NcoI、BamH I等限制性內切酶、質粒精提試劑盒和膠回收試劑盒購自大連寶生物公司；病毒基因組提取試劑盒購自天根公司；質粒大量提取試劑盒購于Omega公司。

1.4引物

應用Oligo7.0軟件，以GenBank上發表的DEV Clone-03基因組序列（ACC.No.DQ227739）為參考，設計引物T1、T4，用于擴增TK基因及其側翼序列。

T1: 5'-GACGTGTTGGCATCGGTTC-3'；

T4: 5'-CCATGTGCAGCATTACGATGTC-3'

以本研究室已經構建的質粒pUS10-HN模板設計引物P6、Pbupper，用于擴增含有HN基因的表達盒。

P6: 5'-GCGGCGACGGACAAACCACAACTAGAA-3'；

Pbupper: 5'-CGGCTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCA -3'

1.5同源臂pTK的擴增和克隆

提取DEV Clone-03的基因組，應用引物T1、T4 進行PCR擴增，將PCR產物克隆至PMD18-T simple載體中，構建同源臂pTK，并進行PCR、酶切鑒定并測序。將pTK用NcoI酶切，T4 DNA聚合酶補平末端后，膠回收純化。

1.6轉移載體pTK-HN的構建

以實驗室構建的pUS10-HN質粒為模板，以P6和Pbupper為引物，擴增含有HN基因的表達盒。將PCR產物克隆至上述已經處理的pTK，篩選陽性克隆，進行PCR、酶切鑒定并測序。

1.7重組病毒的篩選和鑒定

以本研究室構建的rDEV TK-EGFP為親本毒株，根據同源重組的原理，利用應用轉染試劑將病毒基因組與轉移載體pTK共轉染接種雞胚成纖維細胞（CEF），當病變達70%～80%收獲病毒并進行蝕斑篩選。在熒光顯微鏡下挑取無熒光的蝕斑，并進行PCR鑒定及測序鑒定。經3輪蝕斑篩選，獲得純化的重組病毒經Western blot和間接免疫熒光（IFA）檢測HN蛋白的表達。按《分子克隆》［13］中所述方法進行Western blot，經一抗、二抗作用后DAB顯色。間接免疫熒光按《分子克隆》［13］所述操作。在接毒后12 h、24 h、48 h和72 h檢測感染細胞，經固定、一抗和二抗作用后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8重組病毒的復制動力學

將重組病毒以0.001 MOI （multiplicity of infection，感染復數）接種鋪有CEF單層的12孔板，分別于接種后12 h、24 h、48 h、72 h和96 h收集細胞及其培養上清，每個時間點收集3個獨立孔，按Reed和Muench方法進行TCID50測定并繪制生長曲線。

1.9重組病毒遺傳穩定性

將重組病毒在CEF連續傳代至20代，每5代進行PCR、Western blot和間接免疫熒光檢測，檢測重組病毒在基因水平和蛋白水平的遺傳穩定性。將重組病毒接種CEF細胞，待細胞病變效應（CPE）達到80%～90%時收獲病毒，連續傳代20代。同時將重組病毒接種SPF雞胚，接毒72 h后收毒，連續傳代20代。每5代進行PCR、間接免疫熒光、Western blot檢測。

2　結果

2.1同源臂pTK的鑒定

對質粒pTK進行酶切鑒定和PCR鑒定，對重組質粒用Mlu Ⅰ（5.6 kb）、Not Ⅰ（5.6 kb）、Sal Ⅰ（5.6 kb）、Xho Ⅰ（5.6 kb）、BamH Ⅰ（2.1 kb+3.5 kb）和Nco Ⅰ（5.1 kb+0.5 kb）進行酶切鑒定。利用引物T1、T4進行PCR檢測，獲得約2.9 kb大小的片段。酶切結果、PCR結果與預期結果一致（圖1）。

1: Mlu Ⅰ酶切鑒定pTK；2: Not Ⅰ酶切鑒定pTK；3: Sal Ⅰ酶切鑒定pTK；4: Xho Ⅰ酶切鑒定pTK；5: BamH Ⅰ酶切鑒定pTK；6: Nco Ⅰ酶切鑒定pTK；M: DL15000 DNA Marker；7: PCR鑒定pTK圖 1　同源臂pTK的鑒定1: pTK digested by Mlu Ⅰ；2: pTK digested by Not Ⅰ；3: pTK digested by Sal Ⅰ；4: pTK digested by Xho Ⅰ；5: pTK digested by BamH Ⅰ；6: pTK digested by Nco Ⅰ；M: DL15000 DNA Marker；7: Identification of pTK by PCRFigure 1　Identification of homologous arm pTK

2.2轉移載體pTK-HN的鑒定

分別用Mlu I、Hind Ⅲ、Nhe Ⅰ、Not Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和Hpa Ⅰ限制性內切酶對轉移載體pTK-HN進行酶切鑒定，片段大小與預期一致（圖2）。用HU+HL（1.7 kb）和P6+Pbupper（預期2.6 kb）兩對引物進行PCR檢測，并用引物對T1+Pbupper（預期3.2 kb）、P6+T4（預期4.4 kb）進行交叉PCR檢測，電泳結果與預期大小一致（圖2）。將質粒送華大基因公司測序，測序結果與預期結果一致。

2.3重組病毒的蝕斑純化與鑒定

1: Mlu Ⅰ酶切鑒定pTK-HN；2: Hind Ⅲ酶切鑒定pTK-HN；3: Nhe Ⅰ酶切鑒定pTK-HN；M: DL15000 DNA Marker；4: Not Ⅰ酶切鑒定pTK-HN；5: EcoR Ⅴ酶切鑒定pTK-HN；6: Pst Ⅰ酶切鑒定pTK-HN；7: SmaⅠ酶切鑒定pTK-HN；8: Hpa Ⅰ酶切鑒定pTK-HN；9: 以HU+HL為引物PCR；10: 以P6+Pbupper為引物PCR；11: 以T1+Pbupper為引物PCR鑒定；12: 以P6+T4為引物PCR圖 2　轉移載體pTK-HN的PCR和酶切鑒定1: pTK-HN digested by Mlu Ⅰ；2: pTK-HN digested by Hind Ⅲ；3. pTK-HN digested by Nhe Ⅰ；M: DL15000 DNA Marker；4: pTK-HN digested by Not Ⅰ；5: pTK-HN digested by EcoR Ⅴ；6: pTK-HN digested by Pst Ⅰ；7: pTK-HN digested by Sma Ⅰ；8: pTK-HN digested by Hpa Ⅰ；9: PCR by prime HU and HL；10: PCR by prime P6 and Pbupper；11: PCR by prime T1 and Pbupper；12: PCR by prime P6 and T4Figure 2　Identification of transfer vector pTK-HN by PCR and restriction enzyme analysis

2.3.1蝕斑純化親本病毒rDEV TK-EGFP基因組中的EGFP被新城疫的HN基因替換，所以重組病毒不會表達綠色熒光蛋白。在熒光顯微鏡下挑取不表達綠色熒光蛋白的重組病毒蝕斑進行擴增培養并進行鑒定，經過三輪蝕斑純化，獲得純化的重組病毒，將該重組病毒命名rDEV TK-HN。分別利用PCR、Western blot和間接免疫熒光等方法對rDEV TK-HN重組病毒進行檢測。蝕斑純化結果（圖3），三張圖片從左到右分別是在可見光下、綠色熒光、可見光和綠色熒光同時打開下拍攝。純化后進行PCR檢測、酶切檢測以及交叉PCR檢測（圖4）。

A1～3: 第一代重組病毒rDEV TK-HN蝕斑形態；B1～3: 第二代重組病毒rDEV TK-HN蝕斑形態；C1-3: 第三代重組病毒rDEV TK-HN蝕斑形態圖 3　重組病毒rDEV TK-HN蝕斑形態A1-3: F1 plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HN；B1-3: F2 plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HN；C1-3: F3 plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HNFigure 4　Plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HN

1: PCR鑒定重組病毒；2: BamH Ⅰ酶切PCR產物；M: 250 bp DNA Marker；3: 以T1+HU為引物PCR；4: 以HL+T2為引物PCR圖 4　重組病毒rDEV TK-HN PCR、酶切和交叉PCR檢測1: Identification of recombinant virus by PCR；2: PCR products digested by BamH I；M: 250 bp DNA Marker；3: PCR by prime T1 and HU；4: PCR by prime HL and T2Figure 4 Identification of recombinant virus rDEV TK-HN by PCR，restriction enzyme analysis and cross-PCR

2.3.2間接免疫熒光和Western blot檢測間接免疫熒光檢測，在熒光顯微鏡下拍照如圖5。感染重組病毒的CEF中可見熒光，說明重組病毒與雞抗HN抗體反應，重組病毒中HN基因獲得表達。對照CEF不與雞抗HN抗體發生反應（圖5）。

Western blot檢測結果表明，重組病毒rDEV TK-HN能夠正確表達NDV HN蛋白，大小約為74 000，與預期糖基化HN蛋白大小一致，而在DEV Clone-03 和CEF對照中未檢測到HN蛋白條帶（圖6）。

2.3.3復制動力學的測定復制動力學結果表明，重組病毒rDEV TK-HN與其親本毒rDEV TK-EGFP病毒滴度相近，生長趨勢相似，在感染后72 h病毒滴度達到高峰，感染后96 h開始下降。與野生型病毒DEV Clone-03相比，重組病毒滴度略有下降（圖7）。

A: CEF細胞對照；B: CEF感染rDEV TK-HN后12 h；C: CEF感染rDEV TK-HN后24 h；D: CEF感染rDEV TK-HN后48 h；E: CEF感染rDEV TK-HN后72 h圖 5　間接免疫熒光檢測重組病毒rDEV TK-HN感染單層CEF細胞后HN基因的表達情況A: CEF control；B: CEF 12 h post infection with rDEV TK-HN；C: CEF 24 h post infection with rDEV TK-HN；D: CEF 48 h post infection with rDEV TK-HN；E: CEF 72 h post infection with rDEV TK-HNFigure 5　Expression of HN gene in recombinant virus rDEV TK-HN detected by IFA

M: Prestained protein marker；1: 重組病毒rDEV TK-HN尿囊毒；2: DEV Clone-03尿囊毒；3: 未接毒尿囊液對照圖 6　Western blot檢測重組病毒HN基因的表達M: Prestained protein marker；1: Allantotoxicon of the recombinant virus rDEV TK-HN；2: Allantotoxicon of DEV Clone-03；3: Allantoic fluid controlFigure 6　Expression of HN gene in recombinant virus detected by Western blot

2.4遺傳穩定性鑒定

圖 7　重組病毒rDEV TK-HN生長曲線Figure 7　Recombinant virus rDEV TK-HN replication curve

對重組病毒rDEV TK-HN每5代進行PCR、間接免疫熒光和Western blot檢測。應用HN基因特異性引物HU+HL，能夠檢測到HN基因，大小約1.7 kb，表明NDV HN基因隨重組病毒的傳代而穩定遺傳（圖8）。間接免疫熒光結果表明，重組病毒在傳代至5、10、15、20代時能夠檢測到HN蛋白的表達（圖9），說明重組病毒在CEF和雞胚中連續傳代至20代，HN蛋白能夠隨重組病毒的傳代而穩定表達。

M: 250 bp marker；1: 第5代PCR；2: 第10代PCR；3: 第15代PCR；4: 第20代PCR圖 8　重組病毒rDEV TK-HN F5、F10、F15、F20代的PCR檢測結果M: 250 bp marker；1: F5 PCR；2: F10 PCR；3: F15 PCR；4: F20 PCRFigure 8　Identification of the 5th、10th、15th and 20th of the recombinant virus rDEV TK-HN by PCR

3　討論

鴨病毒性腸炎是鴨的一種重要疫病，鴨感染該病毒后潛伏期通常為2～5 d，病鴨、潛伏期感染鴨及病愈不久的帶毒鴨是該病的傳染源，帶毒時間可長達4年［14，15］。水禽是新城疫病毒的主要攜帶者，鴨等水禽感染新城疫后死亡率較高。近年報道的感染水禽的新城疫主要是基因Ⅶ型新城疫，它對水禽的致病性較高。

圖 9　間接免疫熒光檢測rDEV TK-HN重組病毒F5、F10、F15、F20 HN基因表達Figure 9　Expression of HN gene in the 5th、10th、15th and 20th of the recombinant virus rDEV TK-HN detected by IFA

為了建立能夠同時檢測鴨腸炎病毒和新城疫病毒的檢測方法，對實驗動物培育和疫病檢測凈化提供基礎，本研究利用同源重組技術將DEV Clone-03基因組進行改造，構建表達NDV HN基因的重組鴨腸炎病毒。與其親本毒DEV Clone-03和rDEV TK-EGFP相比，重組病毒的蝕斑形態和大小與親本病毒一致，病毒滴度下降了近十倍，與Wang等［16］構建的較親本毒毒力下降50～100倍的重組病毒相比，本研究選擇的插入位點對病毒復制的影響相對較小。IFA檢測表明在重組病毒感染CEF后12 h即可檢測到HN基因的表達，隨著感染細胞的增加HN基因的表達量也逐漸增加。在生長曲線和遺傳穩定性進行研究中，重組病毒滴度略有下降，但復制趨勢與親本病毒一致。重組病毒連續傳代20代，每五代進行PCR、Western blot和IFA檢測，結果表明HN基因隨病毒體外傳代穩定遺傳且穩定表達。綜上，通過DEV病原的基因修飾，構建了TK缺失表達NDV HN基因的重組鴨腸炎病毒且重組病毒能夠攜帶NDV HN基因穩定遺傳，以期建立能夠同時檢測鴨腸炎病毒和新城疫病毒的檢測方法，為實驗動物（鴨等水禽）培育和疫病的檢測和凈化奠定了基礎。

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Construction of Recombinant Duck Enteritis Virus with HN Gene of Newcastle Disease Virus

LIANG Shu-lin1，LI Hui-xin2，CHEN Hong-yan3，LIU Sheng-wang1，2
（1. College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2. Innovation Team of Disease of Avian Respiratory Tract，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China；3. Experimental Animal Center，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China）

ObjectiveTo construct the recombinant duck enteritis virus （DEV） expressing the HN gene of Newcastle disease virus （NDV）. MethodsThe HN gene of NDV was inserted into TK gene of DEV Clone-03 by homologous recombination technology. rDEV TK-EGFP which was constructed as parent virus，by means of cotransfection of the viral genome and transfer vector and plaque purification，the recombinant duck enteritis virus was obtained expression the HN gene of Newcastle disease virus. ResultsThe HN gene of NDV was inserted into DEV genome correctly and expressed effectively on gene and protein level. Replication kinetics and the genetic stability detection of the recombinant virus rDEV TK-HN proved that the titer of rDEV TK-HN decreased slightly，but the trend was consistent with the parent virus replication. After 20 passages in chicken embryo fibroblast and SPF chicken embryos，it showed that the HN gene was of good genetic and expression stability with the passage of the virus. ConclusionBy homologous recombination technology and modifying duck enteritis virus genome，the recombinant virus which could carry the HN gene of NDV was constructed and the virus was of good genetic and expression stability.

Duck enteritis virus （DEV）；Newcastle disease virus （NDV）；HN gene；Recombinant virus；Genetic modification

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0195-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.004

2014-12-26

梁殊林（1988-），女，碩士，動物學，E-mail: liangshulin2010@163.com

劉勝旺（1969-），男，研究員，博士生導師，E-mail: swliu@hvri.ac.cn