PCR和限制性內切酶在uPA-SCID小鼠基因型鑒定中的應用

徐春華，陳麗香，任曉楠，楊玉琴，彭秀華，蔡家麟，周曉輝，周文江，2

（1. 上海市公共衛生臨床中心，上海 201508；2. 復旦大學藥學院，上海 201203）

PCR和限制性內切酶在uPA-SCID小鼠基因型鑒定中的應用

徐春華1，陳麗香1，任曉楠1，楊玉琴1，彭秀華1，蔡家麟1，周曉輝1，周文江1，2

（1. 上海市公共衛生臨床中心，上海 201508；2. 復旦大學藥學院，上海 201203）

目的建立一種簡便、快捷、準確的基因型鑒定方法用于uPA-SCID小鼠的基因型鑒定。方法應用PCR技術與限制性內切酶相結合的方法檢測uPA-SCID小鼠的基因型。結果uPASCID小鼠的uPA基因型鑒定結果顯示: uPA基因野生型在153 bp有條帶，純合子在337 bp有條帶，雜合子在337 bp、153 bp有條帶。uPA-SCID小鼠的SCID基因型鑒定結果顯示: uPA-SCID小鼠SCID基因突變體在38 bp、26 bp有條帶，雜合子在64 bp、38 bp、26 bp有條帶，野生型在64 bp有條帶。結論建立的基因型鑒定方法簡便易行、可靠，通過該方法可以確定uPA-SCID小鼠的基因型，篩選出需要的純合子uPA-SCID小鼠。

uPA-SCID小鼠；基因型鑒定；聚合酶鏈反應（PCR）；限制性內切酶

uPA-SCID小鼠由SCID小鼠與uPA轉基因小鼠雜交、自交后產生［1，2］，該小鼠整合了這兩個品系小鼠的特點，既患有嚴重的肝臟疾病，又缺失適應性免疫系統［3］。由于uPA-SCID小鼠的肝細胞所具有的代謝缺陷，使移植的外源細胞比小鼠自身的肝細胞更容易存活［4］，這些特質使它們的肝臟可成功復育異種（人）肝，可作為人肝細胞移植的模型［3，5］。

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是1980年代中期發展起來的體外核酸擴增技術［6，7］，具有靈敏度高、特異性性強、操作簡便等特點，因此已在各領域被廣泛應用。但正因為敏感度高，易受其他因素的影響，要得到準確可靠的反應結果，需根據不同的模板，摸索最適合的條件，配制出PCR反應試劑。作者經過多次的重復實驗，找到了最適合uPA-SCID小鼠uPA基因DNA的PCR擴增條件。

限制性核酸內切酶是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶，但對自身DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。人類在基因工程中則是利用其可以識別特定的位點，從而產生已知序列的粘性末端，這樣就可以與PCR技術等其他基因工程手段結合［8-10］，實現對基因的切斷。

uPA-SCID小鼠近年來才在國際上應用較廣泛。上海公共衛生臨床中心實驗動物部從美國Jackson實驗室引入SCID小鼠和uPA轉基因小鼠，育成了uPA-SCID小鼠（國內尚未見報道）。為了繁育及后續實驗的需要，須準確、快速地區分野生型、雜合子、純合子的uPA-SCID小鼠。作者應用PCR和限制性內切酶相結合，建立了uPA-SCID小鼠基因型鑒定的方法流程，在1.5 d內就能篩選出雜合子和純合子的uPA-SCID小鼠。

1　材料與方法

1.1實驗動物繁殖及處理

SCID小鼠和uPA轉基因小鼠引自美國Jackson實驗室，原代種鼠在上海市公共衛生臨床中心實驗動物部［SCXK（滬）2010-0024］隔離器中飼養4周后，采用雄∶雌=1∶1的同居方式進行繁殖，母鼠妊娠后單籠飼養。產生F1代小鼠之后，用F1代小鼠自交產生F2代小鼠。再將F2代中的uPA純合子小鼠與SCID純合子小鼠雜交，產生uPA-SCID小鼠。

1.2試劑和儀器

DNA提取試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司；限制性內切酶購自New England公司；DNA Marker DL 2000購自廣州杰順生物科技有限公司；Mark購自Promega公司；實驗使用的儀器有: Eppendorf臺式高速離心機、Eppendorf移液槍，PK-8D型恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司），BCT-Power 600電泳儀（Baygene公司）；BIO-RAD凝膠圖像處理系統；HL-2000雜交爐（UVP公司）和T3000 thermocycler PCR儀（Bionetra公司）。

1.3基因型鑒定方法

1.3.1小鼠基因組DNA的抽取剪取2周齡小鼠的尾組織約3 mm，將小鼠尾組織置于含20 μL蛋白酶K溶解液及250 μL裂解液（DNA基因提取試劑盒中）的Eppendorf管中，在56 ℃的水浴鍋中消化過夜，并按照血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒的操作步驟抽提基因組DNA。

1.3.2小鼠基因組DNA的PCR擴增（a） uPA-SCID小鼠uPA基因DNA的PCR擴增: 將已經提取的小鼠組織DNA取1 μL樣品作為反應模板，PCR擴增采用25 μL體系: 2×PCR master mix 12.5 μL，引物oIMR0432（10 μmol/L）0.5 μL，引物oIMR0433 （10 μmol/L） 0.5 μL，引物oIMR0434（10 μmol/L） 0.5 μL，模板1 μL ，ddH2O 10 μL。PCR反應條件: 94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃保持2 min，10 ℃ 保存。（b） uPA-SCID小鼠SCID基因DNA的PCR擴增: 將已經提取的小鼠組織DNA取2 μL樣品作為反應模板，PCR擴增采用50 μL體系: 2×PCR Master mix 25 μL，正向引物（20 μmol/L） 0.5 μL，反向引物（20 μmol/L） 0.5 μL（鑒定的引物序列為: 正向引物5'-GGA AAA GAA TTG GTA TCC AC-3'，反向引物5'-GTTGGCCCCTGCTAACTTTC-3'），模板DNA 2 μL，ddH2O 22 μL。 PCR反應條件: 94 ℃預變性1.5 min，94℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環，72 ℃保持2 min，10 ℃ 保存。

1.3.3限制性內切酶消化PCR產物每個樣品取5 μL uPA-SCID小鼠SCID基因DNA的PCR擴增產物加入0.5 μL Alu1進行酶切，在HL-2000雜交爐消化3 h。

1.3.4瓊脂糖凝膠電泳法分離消化過的PCR 產物及分析PCR反應結果的基因型鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳法。（a）uPA-SCID小鼠uPA基因型鑒定：首先制備10 g/L的瓊脂糖凝膠，放入電泳槽中，加適量電泳緩沖液，最后加入 uPA-SCID小鼠uPA基因DNA 的PCR擴增產物，130 V電壓30 min，對產物進行分析。 （b）uPA-SCID小鼠SCID基因型鑒定: 首先制備50 g/L瓊脂糖凝膠，放入電泳槽中，加適量電泳緩沖液，最后加入經限制性內切酶消化過的PCR產物，電泳1h，對產物進行分析，若為野生型則無法被Alu1酶切，若為SCID突變體則會被切為幾個小片段。

2　結果

2.1uPA-SCID小鼠uPA基因型鑒定結果

用PCR檢測uPA-SCID小鼠uPA基因型，uPA基因野生型在153 bp有條帶，純合子在337 bp有條帶，雜合子在337 bp、153 bp有條帶（圖1）。

圖 1　uPA-SCID小鼠uPA基因型鑒定結果

2.2uPA-SCID小鼠SCID基因限制性內切酶酶切基因鑒定結果

用限制性內切酶檢測uPA-SCID小鼠SCID基因型，限制性內切酶消化過的PCR產物表現3種類型，即3種基因型: SCID突變體有2條DNA 帶38 bp，26 bp。SCID雜合子有3條DNA帶64 bp，38 bp，26 bp。野生型有1條DNA帶64 bp（圖2）。

3　討論

乙型肝炎病毒（HBV）感染嚴重威害人類的健康，是全球性的主要問題之一［11］。據估計［12-14］全球大約20億人感染HBV，每年死于肝炎病毒超過100萬人，因此積極尋找和建立HBV感染的動物模型顯得尤為重要。目前，國際上已有部分實驗室成功產生uPA-SCID小鼠，并用此小鼠構建了嵌合小鼠肝臟模型。上海公共衛生臨床中心實驗動物部通過雜交和自交方式，產生uPA-SCID小鼠，并對其基因型進行鑒定，現在已能穩定地繁育。

圖 2　uPA-SCID小鼠SCID基因限制性內切酶酶切基因鑒定結果

PCR技術需根據不同的模板摸索最適合的條件，配制PCR反應試劑。經過許多次的重復實驗，作者找到了最適合uPA-SCID小鼠DNA的PCR擴增條件，并改進了從小鼠尾組織中提取DNA的方法，能有效防止DNA的污染。

在應用PCR擴增DNA片段的基礎上，利用SCID突變體小鼠與其親本株C.B-17小鼠的DNA測序結果不同，在Tyr-4046位發生了堿基T A的突變，從而形成新的內切酶Alu1識別位點這一特性，將PCR產物通過限制性內切酶Alu1進行酶切，測定uPA-SCID小鼠的SCID基因型。該方法不但有效解決了單純運用PCR技術檢測uPA-SCID小鼠的SCID基因型時假陽性率高的問題，同時操作簡便易行，鑒定結果準確。

uPA- SCID小鼠接種異種肝細胞應該在出生后盡早進行，因此基因型鑒定過程的時間長短是一個很重要的因素。運用PCR結合限制性內切酶的方法，采用新生2周齡仔鼠作為基因型鑒定對象［15］，此法只需要很少的生物材料即3 mm的小鼠尾組織，適用于任何年齡小鼠。通過這種方法，從取材到基因型確定可以在一個半工作日內完成。

運用作者建立的uPA- SCID小鼠基因型鑒定方法流程，可以有效地確定uPA-SCID小鼠的基因型，篩選出需要的小鼠供繁育和實驗所用。

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Application of PCR and Restiction Enzyme in Genotype Identification of uPA-SCID Mouse

XU Chun-hua1，CHEN Li-xiang1，REN Xiao-nan1，YANG Yu-qin1，PENG Xiu-hua1，CAI Jia-lin1，ZHOU Xiao-hui1，ZHOU Wen-jiang1，2
（1. Shanghai Clinical Center of Public Health，Shanghai 201508，China，2. School of Pharmacy，Fudan University，Shanghai 201203，China）

ObjectiveTo set up a simple，fast and accurate method for the genotype identification of uPA-SCID mouse . MethodThe genotype of uPA-SCID mouse was detected by using PCR combined with restriction enzyme. ResultThe genotype identification results of uPA showed that the stripes of wild type in 153 bp，the stripes of homozygous in 337 bp，and the stripes of heterozygote in 337 bp and 153 bp. The genotype identification results of SCID showed that the mutant genes stripes in 38 bp and 26 bp，the heterozygote genes stripes in 64 bp，38 bp and 26 bp，and the wild type stripes in 64 bp. ConclusionThe method established is simple and accurate，it can identify the genotypes of uPA-SCID mouse，and screening the needful homozygous uPA-SCID mouse.

uPA-SCID mouse；Genotype identification；PCR；Restriction enzymes

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0218-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.008

2014-08-06

徐春華（1982-），男，從事實驗動物設備管理。E-mail: xuchunhua@shaphc.org

周文江（1965-），男，主任技師，主要從事實驗動物管理及動物模型建立的實驗研究。E-mail: wjzhou@shmu.edu.cn