正交試驗優(yōu)化葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取工藝及其體外抗氧化作用

楊學山，祝 霞，李 潁，楊 婷，韓舜愈

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭 州 730070）

正交試驗優(yōu)化葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取工藝及其體外抗氧化作用

楊學山1，祝 霞2，李 潁2，楊 婷2，韓舜愈2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭 州 730070）

以誘導自溶的葡萄酒泥酵母細胞壁為試材，通過單因素試驗及L9（34）正交試驗優(yōu)化酵母甘露聚糖提取工藝參數(shù)，并對其抗氧化活性進行測定。結(jié)果表明：在料液比1∶17.5（g/mL）、KOH質(zhì)量分數(shù)3%、浸提時間1.5 h、浸提溫度100 ℃的最優(yōu)條件下，甘露聚糖提取率為18.37%；酵母甘露聚糖清除ABTS+·、羥自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基和螯合Fe2+的半數(shù)有效質(zhì)量濃度（EC50）分別為1.156、1.550、9.724、2.387、0.669 mg/mL，具有良好的體外抗氧化活性。

葡萄酒泥酵母；甘露聚糖；提取率；抗氧化活性

甘露聚糖由80%～90%甘露糖和5%～20%蛋白質(zhì)以共價鍵形式連接，位于酵母細胞壁外側(cè)，占細胞壁干質(zhì)量的35%～45%，是免疫功能最強的天然多糖之一［1-2］。隨著葡萄酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，我國每年會產(chǎn)生約40 000 t富含功能多糖的葡萄酒泥酵母，利用其開發(fā)甘露聚糖，既可大大降低原料生產(chǎn)成本，又可避免直接排放造成環(huán)境污染［3-4］。

抗氧化性是多糖生物學活性的重要評價指標之一［5］，具有抗氧化功能的多糖在免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、預(yù)防食品腐敗變質(zhì)等方面均具有積極效果［6-8］。國內(nèi)外學者已對植物和真菌來源的多糖抗氧化活性進行了大量研究［9-13］，但對酵母多糖，特別是甘露聚糖多見于提取方法、結(jié)構(gòu)表征及免疫學活性方面［14-18］，對其抗氧化性評價尚未見報道。本研究以誘導自溶后的葡萄酒泥酵母細胞壁為試材，以甘露聚糖提取率為評價指標，優(yōu)化甘露聚糖提取工藝，并對甘露聚糖抗氧化活性進行研究，旨在為拓展甘露聚糖用途和促進葡萄酒泥酵母資源化開發(fā)提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄酒酵母泥 甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司；甘露糖標準品（純度≥99%）、2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、菲洛嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；醋酸、三氯乙酸、無水乙醇、抗壞血酸、過氧化氫、水楊酸鈉、氯化亞鐵、乙二胺四乙酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TDZ5-WS湘儀離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SL-1001電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1酵母甘露聚糖提取工藝流程

葡萄酒泥→預(yù)處理→酵母細胞誘導自溶→KOH提取→脫蛋白精制→乙醇醇析（2∶1，mL/g）→丙酮、乙醚洗滌（2∶1，mL/g）→透析→干燥→甘露聚糖樣品

1.3.2操作要點

葡萄酒泥預(yù)處理：收集葡萄酒酒泥，與蒸餾水以1∶1（g/mL）混合，用80目篩篩分，4 000 r/min離心15 min，重復上述步驟，直至上清液無色透明為止，收集濕酵母備用［3］。誘導自溶：參照本實驗室建立的方法，取酵母細胞懸浮于30 mL pH 4.5、添加質(zhì)量分數(shù)2%NaCl的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，47.5 ℃誘導自溶33 h。甘露聚糖提?。喝?.5 g酵母自溶后細胞壁，以料液比1∶15（g/mL）、添加質(zhì)量分數(shù)為3%的KOH混懸，100 ℃浸提2.0 h。脫蛋白精制：向含有甘露聚糖的上清液中加入質(zhì)量分數(shù)9%的三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH 3，4 ℃靜置12 h除去蛋白質(zhì)［19］，上清液加入無水乙醇醇析12 h，丙酮、乙醚洗滌后沉淀用蒸餾水溶解，所得溶液依次用自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，透析完成后，將透析袋（8 000～14 000 D）內(nèi)溶液進行冷凍干燥即得甘露聚糖。

1.3.3單因素試驗設(shè)計

參照文獻［1 4］及預(yù)實驗結(jié)果，固定其他因素水平，分別考察料液比（1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20）、KOH質(zhì)量分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%）、浸提時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）和浸提溫度（80、90、100、110、120 ℃，溫度超過90 ℃使用高壓滅菌鍋）對甘露聚糖提取率的影響。

1.3.4正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取的正交試驗因素和水平，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，優(yōu)化甘露聚糖提取工藝，重復3次。

1.3.5甘露聚糖含量的紫外分光光度法［20］測定

1.3.5.1標準曲線制作

準確配制甘露糖質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、150、175、200 μg/mL的系列溶液，在280 nm波長條件下，分別測定甘露糖在90% H2SO4溶液中不加NaCl-H3BO3（A1）或加NaCl-H3BO3（A2），70 ℃水浴25 min 條件下的吸光度（A），甘露糖含量與ΔA值（A1-A2）呈線性相關(guān)。實驗所得標準曲線回歸方程為y=0.001 3x+0.002 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表明甘露糖在所取質(zhì)量濃度范圍內(nèi)吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.3.5.2樣品處理

稱取2 0 m g甘露聚糖，不斷碾磨使其溶解于2.5 mL 72% H2SO4溶液中，室溫放置3 h，加蒸餾水使硫酸的最終濃度為4 mol/L左右，然后100 ℃酸水解4 h，取出冷卻至室溫，用NaOH調(diào)pH值至中性，再用0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液定容至100 mL。

1.3.5.3甘露糖樣品質(zhì)量濃度測定

取0.2 mL樣液，按1.3.5.1節(jié)方法測吸光度，求得ΔA，根據(jù)標準曲線計算甘露糖質(zhì)量濃度。

1.3.6甘露聚糖提取率計算

1.3.7甘露聚糖抗氧化活性測定

1.3.7.1抗氧化物制備

在上述優(yōu)化條件下提取甘露聚糖，參照文獻［16］方法，采用活性炭脫色法去除甘露聚糖中的色素成分。濃縮、干燥后配制質(zhì)量濃度為0.1、0.6、1.1、1.6、2.1、2.6、3.1 mg/mL的甘露聚糖測定液，并分別配制相同質(zhì)量濃度的陽性對照VC和EDTA溶液。

1.3.7.2ABTS+·清除能力測定

參照文獻［21］方法。按式（3）計算甘露聚糖對ABTS+·清除率，用同等質(zhì)量濃度的VC做陽性對照，重復3 次。

式中：A0為ABTS工作液和乙醇的吸光度；A1為ABTS工作液和甘露聚糖的吸光度。

1.3.7.3羥自由基清除能力測定

參照文獻［21］方法。按式（4）計算甘露聚糖對羥自由基清除能力，以VC為陽性對照，重復3 次。

式中：A0為羥自由基吸光度；A1為加入甘露聚糖溶液的吸光度；A2為只含甘露聚糖溶液的吸光度。

1.3.7.4DPPH自由基清除能力測定

參照文獻［22］方法。按式（4）計算甘露聚糖對DPPH自由基清除率，以VC為陽性對照，重復3 次。

式中：A0為DPPH自由基和磷酸鈉鹽緩沖液的吸光度；A1為DPPH和甘露聚糖溶液的吸光度；A2為甘露聚糖和磷酸鈉鹽緩沖液的吸光度。

1.3.7.5超氧陰離子自由基清除能力測定

參照文獻［22］方法。按式（6）計算甘露聚糖對超氧陰離子自由基清除率，對VC為陽性對照，重復3 次。

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA1為加入甘露聚糖水解液后鄰苯三酚的氧化速率；A2為只含甘露聚糖時溶液的吸光度。

1.3.7.6Fe2+螯合能力測定

參照文獻［23］方法。按式（7）計算甘露聚糖對Fe2+螯合能力，以EDTA為陽性對照，重復3 次。

式中：A0為不含甘露聚糖溶液吸光度；A1為在甘露聚糖存在時溶液吸光度。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）計算

實驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0進行分析處理。

EC50是指清除率為50%時甘露聚糖、VC或EDTA的質(zhì)量濃度，采用Logit回歸計算。EC50可作為評價抗氧化能力的重要參數(shù)，如某種物質(zhì)的EC50低于10 mg/mL，則表明其具有很好的抗氧化活性［12］。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1料液比對甘露聚糖提取率的影響

圖1　料液比對甘露聚糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on the extraction yield of mannan

由圖1可知，料液比為1∶15（g/mL）時，甘露聚糖提取率達到最大值12.57%，因此選擇其為較佳料液比。料液比在1∶15（g/mL）之前時，甘露聚糖提取率隨溶劑用量的增加而增加，說明在料液比較低時，影響細胞壁分散，提取劑作用不徹底；料液比在1∶15（g/mL）之后時，提取率有所下降，可能是增大溶劑用量時，增加了后續(xù)提取處理的難度，引起提取物的損失［15］。

2.1.2KOH質(zhì)量分數(shù)對甘露聚糖提取率的影響

隨著近幾年服務(wù)行業(yè)的迅猛發(fā)展，服務(wù)供應(yīng)鏈的研究逐漸受到了學者們的重視。服務(wù)供應(yīng)鏈包括各個不同的節(jié)點，一般是服務(wù)提供商、服務(wù)集成商和客戶等，各個企業(yè)在自身經(jīng)營過程中，由于逐利性會導致各個節(jié)點企業(yè)在空間、時間等方面產(chǎn)生矛盾，不易實現(xiàn)整體的協(xié)調(diào)，而服務(wù)供應(yīng)鏈各節(jié)點企業(yè)的協(xié)調(diào)與否與服務(wù)供應(yīng)鏈績效有著莫大的關(guān)系。因此，服務(wù)供應(yīng)鏈上下游關(guān)系的有效協(xié)調(diào)至關(guān)重要。服務(wù)供應(yīng)鏈是由服務(wù)各方因共同合作而產(chǎn)生的供應(yīng)鏈,由于服務(wù)的特性使然，與傳統(tǒng)的產(chǎn)品供應(yīng)鏈相比，服務(wù)供應(yīng)鏈中各參與方之間的關(guān)系有較大的不同。這些差異的特征逐漸引起了學者的興趣。

圖2　KOH質(zhì)量分數(shù)對甘露聚糖提取率的影響Fig.2 Effect of KOH concentration on the extraction yield of mannan

圖3　浸提時間對甘露聚糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of mannan

由圖2可知，當KOH質(zhì)量分數(shù)為3%時，甘露聚糖提取率為12.02%，提取效果好，所以選擇3%為KOH作用質(zhì)量分數(shù)。KOH質(zhì)量分數(shù)小于3%時，低質(zhì)量分數(shù)KOH對細胞壁作用不充分；反之，高質(zhì)量分數(shù)的KOH對甘露聚糖的結(jié)構(gòu)破壞較大，導致提取率降低［19］。

2.1.3浸提時間對甘露聚糖提取率的影響

由圖3可知，浸提時間為2 h時，甘露聚糖提取效果最好，提取率為12.36%，所以選擇2 h為較佳浸提時間。浸提時間小于2 h 時，由于時間較短，提取不充分；當浸提時間大于2 h時，隨著浸提時間延長，甘露聚糖降解，使其提取率降低。

2.1.4浸提溫度對甘露聚糖提取率的影響

圖4　浸提溫度對甘露聚糖提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction yield of mannan

由圖4可知，浸提溫度不同，甘露聚糖提取率不同。甘露聚糖在90 ℃時，提取率達13.19%，所以選擇90 ℃為較佳浸提溫度。當溫度小于90 ℃時，提取率隨溫度的升高呈上升趨勢，說明較高的溫度有利于浸提反應(yīng)進行；過高的浸提溫度會在一定程度破壞甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使提取率呈現(xiàn)下降趨勢［17］。

2.2正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以甘露聚糖提取率為考察指標，進行了L9（34）正交試驗，試驗結(jié)果見表1。通過直觀分析和極差分析得到最優(yōu)組合，確定葡萄酒泥酵母甘露聚糖的最優(yōu)提取工藝條件。

表1　L 1 L9（334）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Le 1 L9（3 34） orthogonal array design and experimental results） orthogonal array design and experimental results

由表1可知，影響甘露聚糖提取效果因素的主次順序為：D＞C＞A＞B，由K值可以確定其正交試驗的最優(yōu)組合為A3B2C1D3，即料液比1∶17.5（g/mL）、KOH質(zhì)量分數(shù)3%、浸提時間1.5 h、浸提溫度100 ℃。

表2　正交試驗方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for the orthogonal array design

為了驗證工藝條件的可靠性，在最優(yōu)條件下提取甘露聚糖3 次，提取率平均值為18.37%。與梁新樂等［15］使用質(zhì)量分數(shù)6%的KOH，甘露聚糖提取率4.65%相比，堿用量降低了3%，提取率提高了4 倍左右；與朱紅蕾等［16］使用質(zhì)量分數(shù)5%的NaOH溶液，甘露聚糖提取率4.4%相比，堿用量降低了2%，提取率提高了4 倍左右。由此可見，采用正交優(yōu)化試驗得到提取甘露聚糖最佳條件的數(shù)據(jù)可靠，具有使用價值。

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，由表2可知，因素C和D在P＜0.05的水平上有顯著性差異，因素A和B不顯著。

2.3甘露聚糖的抗氧化性

2.3.1甘露聚糖對ABTS+·清除能力

圖5　甘露聚糖及VC對ABBTTSS+·清除作用Fig.5 Scavenging effects of mannan and VC on ABTS+radical

測定生物樣品ABTS+·清除能力是評價其總抗氧化能力的一種常用方法［21］。由圖5可知，甘露聚糖清除ABTS+·能力存在質(zhì)量濃度相關(guān)性，甘露聚糖在0～3.1 mg/mL范圍內(nèi)清除率增加趨勢較穩(wěn)定，VC在0～1.6 mg/mL范圍內(nèi)清除率增加明顯，1.6～3.1 mg/mL范圍內(nèi)增加趨勢平緩。甘露聚糖和VC質(zhì)量濃度達到3.1 mg/mL時，對ABTS+·清除率分別為84.85%和98.17%，甘露聚糖和VC對ABTS+·的EC50值分別為1.156 mg/mL和0.134 mg/mL。

2.3.2甘露聚糖對羥自由基清除能力

圖6　甘露聚糖及VC對羥自由基清除作用Fig.6 Scavenging effects of mannan and VC on hydroxyl radical

清除羥自由基對保護生物膜系統(tǒng)、預(yù)防組織破壞和細胞凋亡十分重要［24］。由圖6可知，甘露聚糖具有一定的羥自由基清除能力，清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大。在質(zhì)量濃度為0～0.6 mg/mL時，甘露聚糖及VC對自由基清除率都迅速增加，之后趨勢變緩；甘露聚糖由質(zhì)量濃度由0.6 mg/mL增加至3.1 mg/mL時，羥自由基清除率只增加了14%，低于VC增加值（28.02%）。甘露聚糖和VC的EC50值分別為1.550 mg/mL和0.347 mg/mL。

圖7　甘露聚糖及VC對DPPH自由基清除作用Fig.7 Scavenging effects of mannan and VC on DPPH radical

2.3.3甘露聚糖對DPPH自由基清除能力待測樣品清除DPPH自由基能力可評價其阻斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的水平［21，24］。由圖7可知，當質(zhì)量濃度達到3.1mg/mL時，甘露聚糖和VC對DPPH自由基清除率分別為39.86%和97.88%。甘露聚糖和VC清除DPPH自由基的EC50值分別為9.724 mg/mL和0.316 mg/mL，甘露聚糖清除DPPH自由基能力低于VC。

2.3.4甘露聚糖對超氧陰離子自由基清除能力

圖8　甘露聚糖及VC對超氧陰離子自由基清除作用Fig.8 Scavenging effects of mannan and VC on superoxide anion radical

圖9　甘露聚糖及EDTA對Fee2+螯合作用Fig.9 Chelating effects of mannan and EDTA on Fe2+

超氧陰離子自由基盡管氧化作用較弱，但其能夠轉(zhuǎn)化成具有更強氧化能力的單線態(tài)氧（1O2）和羥自由基誘導脂質(zhì)過氧化作用，因此清除超氧陰離子自由基十分必要［23］。由圖8可知，甘露聚糖具有一定的超氧陰離子自由基清除能力，VC在0～1.6 mg/mL范圍內(nèi)時，自由基清除率增加較快；甘露聚糖在質(zhì)量濃度0～3.1 mg/mL范圍內(nèi)，清除率變化趨勢平緩；當質(zhì)量濃度達到3.1 mg/mL時，甘露聚糖對超氧陰離子自由基清除率為54.76%，而VC的清除率為98.52%。甘露聚糖和VC的EC50值分別為2.387 mg/mL和0.496 mg/mL。

2.3.5甘露聚糖對Fe2+螯合作用

Fe2+極易催化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他細胞組分氧化，引起組織氧化損傷，對Fe2+螯合能力測定也是評價抗氧化劑抗氧化性能的常用方法［23］。如圖9所示，甘露聚糖具有較強的Fe2+螯合能力，質(zhì)量濃度達到3.1 mg/mL時，甘露聚糖對Fe2+螯合率為82.18%，EDTA對Fe2+螯合率為90.37%，EC50值分別為0.669 mg/mL和0.481 mg/mL。

3　結(jié) 論

以葡萄酒泥酵母為原料，通過單因素試驗及正交優(yōu)化試驗，對影響酵母甘露聚糖提取率的因素料液比、KOH質(zhì)量分數(shù)、浸提時間、浸提溫度進行了研究，通過L9（34）正交試驗優(yōu)化確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶17.5（g/mL）、KOH質(zhì)量分數(shù)3%、浸提時間1.5 h、浸提溫度100 ℃，在此最佳條件下，甘露聚糖提取率為18.37%。

體外抗氧化活性結(jié)果顯示，甘露聚糖抗氧化活性呈較為明顯的量效關(guān)系，對清除ABTS+·、羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和螯合Fe2+的EC50值分別為1.156、1.550、9.724、2.387、0.669 mg/mL，均小于10 mg/mL，具有良好的抗氧化活性。甘露聚糖可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、保健品等行業(yè)，有關(guān)甘露聚糖的抗氧化機理及構(gòu)效關(guān)系有待進一步探討。

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Optimization of Extraction Process and in Vitro Antioxidant Activities of Mannan from Waste Wine Yeast

YANG Xueshan1， ZHU Xia2， LI Ying2， YANG Ting2， HAN Shunyu2
（1. College of Life Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2. College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Single factor experiments and an orthogonal array design L9（34） were used in combination to optimize process parameters for the extraction of mannan from the autolyzed cell wall of waste wine yeast. Antioxidant activities of the extracted mannan were also measured in this study. The results showed t hat under the optimum conditions： 1：17.5 （g/mL），3%， 1.5 h and 100 ℃ for solid-to-liquid ratio， KOH concentration， extraction time and extraction temperature， respectively，the extraction yield of mannan was 18.37%. The mannan from wine yeast displayed excellent antioxidant activ ities with half maximal effective concentration （EC50） values of 1.156， 1.550， 9.724， 2.387 and 0.669 mg/mL for scavenging 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS+）， hydroxyl， 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH），superoxide anion radicals and chelating Fe2+， respectively.

waste wine yeast； mannan； extraction yield； antioxidant activities

TS261.9

A

1002-6630（2015）18-0069-06

10.7506/spkx1002-6630-201518012

2015-01-27

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目（GNSW-2013-21）

楊學山（1977—），男，副教授，碩士，研究方向為生物化學與生物產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn